论文解读：抗菌肽功能化胶原支架的直写成型
一、研究背景
临界尺寸骨缺损（CSBD）尤其是伴随骨折相关感染（FRI）的病例，始终是骨科手术的重大临床挑战。这类缺损无法自发愈合，往往需要复杂外科手术联合长期临床管理；而植入物表面的细菌定植会进一步阻碍骨再生，甚至导致植入失败、反复手术和长期抗生素治疗。因此，开发既能支撑骨再生、又能降低植入部位细菌负荷的生物材料，成为骨组织工程领域的研究热点。
在众多生物材料中，I型胶原凭借优异的生物相容性、可生物降解性以及仿生细胞外基质特性，是骨修复支架的理想基材。与此同时，抗菌肽（AMPs）因具有广谱抗菌活性且不易诱发细菌耐药性，被视为传统抗生素的潜在替代或补充方案，但其稳定性有限、潜在细胞毒性、体内降解快等问题，限制了在生物材料体系中的广泛应用。
KR-12 是人源抗菌肽 LL-37 的最小活性片段，保留了抗菌活性且肽链更短，便于化学修饰。已有研究证实，通过定点氨基酸替换可优化 KR-12 衍生物的稳定性，提升其对骨科感染相关革兰氏阳性菌的杀伤效果。将抗菌肽通过共价方式接枝到胶原支架上，相比非共价负载能显著提升肽的保留率和稳定性，而偶联化学策略会直接影响肽的负载效率与功能可及性。
3D打印技术可制备结构精准可控的支架，其中直写成型（DIW）技术适合挤出成型水凝胶基构建体。但胶原基墨水因可打印性差、成型后结构稳定性不足，相关DIW工艺仍不成熟；主流的FRESH悬浮支撑打印技术需要昂贵的支撑材料和复杂流程。目前，将KR-12衍生物整合到可DIW打印的胶原支架中的研究仍十分有限。
本研究旨在开发一种功能化抗菌胶原生物墨水，通过不同共价偶联策略将KR-12衍生物接枝到胶原上，系统评估偶联方式对肽负载、流变性能、可打印性、抗菌效果及成骨细胞相容性的影响，为感染性骨缺损修复支架提供概念验证。
二、研究内容与实验方法
2.1 核心材料与试剂
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交联剂：EDC（N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺）、NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）
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胶原：牛跟腱来源I型胶原粉末
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偶联试剂：6-马来酰亚胺己酸、N-(2-氨乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐
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定量试剂：HABA、亲和素、PicoGreen dsDNA检测试剂盒、PrestoBlue细胞活力检测试剂
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实验菌株：临床分离金黄色葡萄球菌（假体关节感染来源）、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌
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细胞：人原代成骨细胞（hOBs，取自骨科手术患者骨组织）
2.2 抗菌肽设计与合成
研究采用固相多肽合成法（SPPS）制备两种KR-12衍生物，C端均进行酰胺化修饰以提升净正电荷，N端进行生物素化修饰以实现定量检测：
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KR12-Q5KD9A：对天然KR-12进行定点突变，第5位谷氨酰胺(Q)替换为赖氨酸(K)，第9位天冬氨酸(D)替换为丙氨酸(A)，提升抗革兰氏阳性菌活性。
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cysKR12-Q5KD9A：在KR12-Q5KD9A的N端添加CPGG四氨基酸连接子，引入半胱氨酸残基，用于后续位点特异性硫醇-马来酰亚胺偶联。
图1 两种KR-12衍生物的分子结构，右侧为带半胱氨酸连接子的cysKR12-Q5KD9A
2.3 胶原支架的化学修饰与制备配方
首先制备基础胶原悬液：将1.5 g I型胶原粉末悬浮于100 mL 0.5 M乙酸中，4℃搅拌过夜，得到1.5 wt%的胶原悬浮液，同温储存备用。
研究共制备4组胶原水凝胶，具体配方与合成步骤如下：
（1）对照组：交联胶原 Coll-XL
配方：
20 g 1.5 wt%胶原悬液（干物质300 mg，羧基0.36 mmol，1当量）
EDC 111.15 mg（0.72 mmol，2当量）
NHS 123.60 mg（1.07 mmol，3当量）
溶剂：3 mL去离子水
实验步骤：
1. 将EDC/NHS水溶液加入胶原悬液，用1 M NaOH调pH至5-6，室温搅拌反应4 h；
2. 10℃、3500 rpm离心30 min，去除残留EDC和NHS；
3. 沉淀重悬于PBS，调pH至7.2，再次离心洗涤（PBS 1次、去离子水1次）；
4. 37℃放置5 h完成水凝胶固化。
（2）非选择性直接偶联组：Coll-KR12-Q5KD9A
配方：
20 g 1.5 wt%胶原悬液
EDC 111.15 mg + NHS 123.60 mg
KR12-Q5KD9A 63.72 mg（0.036 mmol，0.1当量）
溶剂：3 mL去离子水
实验步骤：
1. 将EDC、NHS与多肽共同溶于水后加入胶原悬液，调pH 5-6，室温搅拌过夜；
2. 离心后用PBS洗涤2次、去离子水洗涤2次，彻底去除未结合的游离肽和残留试剂；
3. 37℃放置过夜完成固化。
注：该方法通过肽上的赖氨酸氨基与胶原羧基形成酰胺键，属于非选择性偶联。
（3）短连接子位点特异性偶联组：Coll-cysKR12-Q5KD9A SL
配方：
20 g 1.5 wt%胶原悬液
EDC 111.15 mg + NHS 123.60 mg（活化胶原羧基）
N-(2-氨乙基)马来酰亚胺 90.98 mg（0.36 mmol，1当量）
cysKR12-Q5KD9A 65.80 mg（0.036 mmol，0.1当量）
实验步骤：
1. 胶原悬液中加入EDC/NHS，调pH 5-6搅拌30 min，活化胶原上的羧基；
2. 离心去除残留活化剂，沉淀重悬于PBS，调pH至7，加入马来酰亚胺试剂反应2 h；
3. PBS洗涤1次后，加入cysKR12-Q5KD9A的PBS溶液，搅拌过夜，通过硫醇-马来酰亚胺点击反应实现位点特异性偶联；
4. PBS洗2次、去离子水洗2次，37℃固化。
（4）长连接子位点特异性偶联组：Coll-cysKR12-Q5KD9A LL
采用6-马来酰亚胺己酸（6碳长连接子），将马来酰亚胺基团偶联到胶原的氨基上，再与cysKR12-Q5KD9A的半胱氨酸反应。
图3 KR-12衍生物共价整合到胶原纤维的合成路线：A) EDC/NHS直接偶联；B) 短马来酰亚胺连接子（SL）位点特异性偶联；C) 长连接子（LL）位点特异性偶联
肽负载效率检测结果如下：
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组别
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偶联方式
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肽负载量（μmol/g干材料）
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Coll-KR12-Q5KD9A
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非选择性直接偶联
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40 ± 1.2
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Coll-cysKR12-Q5KD9A SL
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短连接子位点特异性偶联
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36 ± 2.1
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Coll-cysKR12-Q5KD9A LL
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长连接子位点特异性偶联
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20 ± 0.8
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LL组负载量显著更低，原因是胶原分子中可用的氨基数量远少于羧基，靶向氨基的长连接子策略偶联效率受限。综合负载效率与化学特性，研究选择Coll-cysKR12-Q5KD9A SL组进行后续深入表征。
2.4 材料理化表征与3D打印
（1）流变性能测试
通过振幅扫描流变仪测试水凝胶的储能模量（G'）：
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Coll-XL 组：6.3 ± 0.1 kPa
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Coll-cysKR12-Q5KD9A SL 组：6.9 ± 0.1 kPa（p=0.0069，显著高于对照组）
结果表明，多肽接枝后水凝胶刚度略有提升，推测是肽与胶原之间形成了额外的氢键等相互作用。
（2）降解性能测试
采用0.01 U/mL的胶原酶溶液进行体外加速降解实验：
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24 h时：Coll-XL保留82%质量，SL组保留86%质量；
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2周（336 h）时：Coll-XL保留74%质量，SL组保留61%质量；
整体来看，多肽的加入并未降低材料的抗降解能力，早期甚至略有提升。该降解速率为体外加速模型，体内实际降解由基质金属蛋白酶介导，周期更长。
（3）3D直写打印工艺
采用开源E3D ToolChanger生物打印机，搭配18G和23G两种针头进行打印：
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模型设计：Fusion 360构建圆柱模型，Simplify3D生成G代码；
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基础参数：默认打印速度1000 mm/min，挤出倍率1.0；18G喷嘴挤出宽度1.00 mm，23G喷嘴挤出宽度0.54 mm；
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工艺优化：通过调整墨水浓度、挤出系数(EF)和速度系数(SF)优化打印质量；23G精细打印时，SL组速度系数提升20%、挤出系数提升50%，可消除丝径不均和积料问题。
图2 支架切片模型：A) 18G喷嘴打印的大尺寸圆柱（14×14×7 mm）；B) 23G喷嘴打印的精细圆柱（10×10×2 mm）
图7 3D打印支架实物（标尺5 mm），23G精细喷嘴打印：A) Coll-XL；B) Coll-cysKR12-Q5KD9A SL
精细打印丝径表征：
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Coll-XL：394 ± 93 μm
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Coll-cysKR12-Q5KD9A SL：487 ± 63 μm
两组丝径无统计学差异（p=0.07），均能实现高保真打印，结构完整性优异。
图8 23G喷嘴打印单层支架的丝径表征：A) Coll-XL显微图；B) Coll-cysKR12-Q5KD9A SL显微图；C) 丝径测量结果（均值±SD，n=6）
（4）表面形貌表征
冷冻干燥后的支架经喷金处理，通过扫描电镜（SEM）观察表面微观形貌，两组支架均呈现典型的胶原多孔纤维结构。
图6 18G喷嘴打印支架的SEM图像：A) Coll-XL；B) Coll-cysKR12-Q5KD9A SL（标尺50 μm）
2.5 抗菌性能评价
采用临床分离的金黄色葡萄球菌（假体关节感染来源）为主要受试菌株，通过悬浮培养法评估支架的抗菌效果：
实验流程：
1. 24孔板中每孔放置1个支架，加入1 mL αMEM培养基；设置无支架阳性对照、空白培养基阴性对照；
2. 细菌复苏后调整浓度至OD₆₀₀=0.15（约10⁵ CFU/mL），每孔接种50 μL菌液；
3. 37℃有氧培养，分别在2 h、24 h取样，涂布LB平板计数活菌数（CFU），同时测定OD₆₀₀反映总生物量。
图9 KR-12功能化胶原支架对金黄色葡萄球菌的抗菌评价：A) 接种2 h的活菌CFU计数；B) 接种24 h的活菌CFU计数；C) 24 h时培养基OD₆₀₀值；*p<0.005，与阳性对照相比有显著差异
核心结果：
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2 h时间点：Coll-cysKR12-Q5KD9A SL组已出现活菌数下降，体现快速抗菌效应；其余两组肽支架与对照组无明显差异；
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24 h时间点：Coll-cysKR12-Q5KD9A SL组CFU显著低于阳性对照（p=0.0039），抗菌效果持续稳定；其余肽组未表现出显著抑菌效果；
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菌种拓展预实验：SL组对大肠杆菌也表现出一定抑制作用，对铜绿假单胞菌和粪肠球菌效果不明显，存在菌种特异性差异。
SL组抗菌性能最优的原因：位点特异性偶联完整保留了肽的正电荷基团，增强与细菌负电细胞膜的相互作用；同时该组肽负载量更高，生物可及性更好。
2.6 成骨细胞相容性评价
（1）间接共培养实验
采用0.4 μm孔径的Transwell小室进行间接共培养，评估支架溶出物的细胞毒性与成骨影响：
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细胞：人原代成骨细胞（hOBs），第4-6代；
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培养周期：2周、4周；第1周用完全培养基，第2周起更换为成骨诱导培养基；
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检测指标：PrestoBlue检测细胞代谢活性、PicoGreen检测dsDNA含量（反映细胞数量）、碱性磷酸酶（ALP）活性（早期成骨分化标志物）。
结果：2周和4周时，支架共培养组的细胞数量、代谢活性、ALP活性均与空白对照组无显著差异，且随培养时间正常增长，说明支架释放的降解产物无细胞毒性，不干扰成骨细胞的早期分化。
（2）直接接种与细胞形貌观察
将成骨细胞直接接种于支架表面，培养14天后通过DAPI染细胞核、鬼笔环肽染肌动蛋白骨架，共聚焦显微镜观察细胞形态：
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细胞在两组支架表面均均匀分布，铺展良好；
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肌动蛋白骨架连续有序，细胞核形态完整，无凋亡碎裂迹象；
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多肽修饰未对细胞黏附和生长产生负面影响。
图10 成骨细胞对胶原-KR-12支架的响应：A) 共培养2、4周的总dsDNA含量；B) 细胞代谢活性；C) ALP成骨分化活性；D) Coll-cysKR12-Q5KD9A SL支架上细胞共聚焦图；E) Coll-XL支架上细胞共聚焦图（标尺200 μm）
三、研究结论
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本研究成功开发了一种抗菌肽功能化的胶原基生物墨水，可通过直写成型（DIW）技术制备具有抗菌活性的3D打印胶原支架，为骨组织工程提供了新的材料方案。
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偶联化学策略是决定材料性能的关键因素：采用短马来酰亚胺连接子的位点特异性偶联方案（Coll-cysKR12-Q5KD9A SL），兼具较高的肽负载效率与良好的肽功能可及性，综合性能最优。
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最优配方具备适合DIW打印的流变性能，可适配18G和23G两种针头，实现高分辨率结构成型；多肽修饰提升了水凝胶刚度，且未损害材料的降解稳定性。
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该支架对骨科感染常见的金黄色葡萄球菌具有显著的抗菌效果，同时对人原代成骨细胞表现出良好的生物相容性，不影响细胞增殖与早期成骨分化。
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本研究为概念验证阶段，后续仍需开展支架表面细菌定植抑制、成熟生物膜清除、体内成骨效能、长期体内安全性等研究，以推动该材料向临床应用转化。
论文基础信息
期刊：Biomaterials Advances, Volume 188, 2026, 文章编号 215000
出版方：Elsevier
通讯作者：Carlos Palo-Nieto（西班牙加的斯大学材料科学系）
合作机构：瑞典乌普萨拉大学骨科实验室、药物生物科学系、人畜共患病科学中心等
DOI：10.1016/j.bioadv.2026.215000
该研究中涉及的3D打印策略
1、森工可匹配模块:
①常温打印模块： 配备精密的调压模块，调压精度±1KP，实现不同粘度材料的稳定打印；
小编对该类研究的拓展设想
1、拓展思路：
①多通道打印模块，实现协同打印不同材料进行交替打印；
②紫外辅助成型模块：用特殊固化（如紫外光）方法，以制备性能更优或响应更智能的结构;
③可搭载低温直写喷头/平台模块该模块支持-5℃-室温，能快速提高固化效率，保障材料打印成型效果.
2、涉及模块介绍：
①2-4通道设计，可装载多材料进行协同/并联打印；
②紫外固化模块支持4波长紫外固化灯（365、385、395、405nm），实现距离、照射角度、光功率等多参数可调;
③低温平台模块采用模块化冷井设计，支持对玻片、孔板（6、12、24、48、96孔）直接使用，有效制冷区域尺寸：90mm*90mm*75mm；控温范围：-5℃-室温.
由于小编学识所限，文中内容难免存在疏漏或不足之处。若您发现任何错误或值得商榷的观点，恳请不吝指正，
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1. 科研型定位,满足科研实验可视化参数需求；
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4. 少量材料即可打印测试，高效产出，节约实验成本；
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5. 支持多喷头多通道多材料多模式打印；
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6. 支持各种外场辅助功能拓展和定制。
