一、研究背景

重症骨缺损是骨科领域最具挑战性的疾病之一，自体骨移植是目前骨再生的金标准，但存在供体短缺、移植物质量不均等局限性。骨髓（BM）因富含骨髓间充质干细胞（BMSCs）和多种生长因子，能提供最优的再生微环境，常与自体骨联合用于临床骨缺损修复，但其在治疗临界骨缺损时仍存在明显不足。

骨髓发挥修复作用的核心局限主要体现在三方面：一是骨髓抽吸物中BMSCs浓度极低（仅0.001%~0.02%），无法为临界骨缺损再生提供足够的干细胞；二是骨髓基质力学性能差，需结合自体骨或脱矿骨基质才能保证力学稳定性；三是骨髓基质降解过快，导致生长因子释放与骨再生的时间进程不匹配，无法持续提供成骨信号。

现有研究虽尝试将BMSCs与生物材料支架结合，但对骨再生的动态微环境模拟不足，且缺乏针对骨修复的成骨微环境特异性工程化设计。因此，借鉴骨髓的再生特性，构建能模拟骨髓功能、实现治疗因子时序释放的骨髓模拟微环境，成为解决临界骨缺损修复的关键研究方向。

水凝胶微球因力学性能可调、可注射性好、能模拟天然细胞微环境，成为时序控释生长因子、重构干细胞微环境的理想载体，为骨髓模拟微环境的构建提供了可行的材料基础。

二、核心研究内容

3.1 研究设计思路

本研究设计了两种具有不同降解速率的杂化水凝胶微球，结合生物活性肽的时序释放特性，构建骨髓模拟微环境：①快速降解的明胶甲基丙烯酰基（GelMA）微球（GM）负载外源性BMSCs并偶联干细胞归巢肽（SKP），实现内源性BMSCs募集并增强干细胞干性；②缓慢降解的壳聚糖甲基丙烯酰基（ChitoMA）微球（CM）负载血管生成肽（KLT）和成骨肽（OGP），实现血管成熟和成骨分化的持续调控。

将两种微球通过静电作用自组装，与3D打印聚乳酸-羟基乙酸共聚物/羟基磷灰石（PLGA/HA）支架结合，形成骨组织工程复合支架，使其释放规律与骨再生的动态过程匹配：早期释放SKP和BMSCs实现干细胞募集与免疫调控，后期释放OGP和KLT实现血管生成与成骨分化，最终在大鼠股骨髁临界骨缺损模型中验证其骨再生效果。

3.2 材料制备与表征

图1. 自组装杂化微球基骨髓模拟微环境的制备与表征。A) GelMA和ChitoMA的分子结构及生物活性肽的氨基酸序列；B) 傅里叶红外光谱：(I) ChitoMA、壳聚糖、GelMA、明胶；(II) KLT、KLT-MA、OGP、OGP-MA、SKP、SKP-MA；C) GelMA微球（GM）和ChitoMA微球（CM）的光学显微镜图像及水相中的平均直径；D) 荧光标记(FAM)SKP/(FAM)SKP-MA修饰GM的图像及荧光定量分析；E、F) GM、GM-SKP、CM、CM-OGP/KLT的扫描电镜图像；G) 肽释放曲线；H) 微球降解曲线；I) 复合微球的剪切稀化特性和可注射性；J) 压缩性能测试用3D打印支架俯视图；K) 支架压缩强度数据（ns=无显著性差异，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，n=3）；L) 生物活性复合支架构建示意图

1）通过微流控芯片制备出粒径均一的GM（179±15 μm）和CM（216±23 μm）微球，傅里叶红外光谱（FTIR）和核磁共振（¹H NMR）验证了MA基团成功接枝，GelMA和ChitoMA的接枝率分别约为60%和20%，生物活性肽也成功甲基丙烯酰化；

2）荧光标记和扫描电镜（SEM）证实肽通过光交联成功偶联在微球上，无明显游离；流变学分析显示肽的引入降低了水凝胶分子网络交联度，提升了吸水率；

3）体外释放和降解实验表明，GM-SKP在10天内实现SKP近完全释放（92%），CM-OGP/KLT实现OGP/KLT的持续释放；GM在胶原酶作用下降解远快于CM，肽的引入轻微加速微球降解；

4）Zeta电位显示GM-SKP带负电、CM-OGP/KLT带正电，可通过静电作用自组装，且杂化微球具有剪切稀化特性，可注射性良好；

5）3D打印PLGA/HA支架具有相互连通的孔隙，抗压强度为4.96±0.54 MPa，弹性模量为0.72±0.04 GPa，与松质骨力学性能相当。

Scheme 1. 自组装杂化水凝胶微球构建骨髓模拟微环境促进骨再生的示意图。A) 自组装杂化水凝胶微球的制备及其与3D打印骨支架的整合；B) 骨髓模拟微环境通过调控BMSCs募集、免疫调节、血管生成和成骨作用调控再生微环境以加速骨再生的机制

3.3 体外细胞实验验证

本研究通过一系列体外实验验证了骨髓模拟微环境的生物相容性、干细胞募集/干性维持、血管生成、免疫调节和成骨分化能力，核心结果如下：

（1）生物相容性

图2. 生物活性水凝胶微球和PLGA/HA支撑支架的生物相容性评价。A) 第3天不同底物表面培养BMSCs的活/死染色和细胞骨架染色图像；B、C) GM-SKP中包裹BMSCs的活/死染色和细胞骨架染色图像

活/死染色和细胞骨架染色显示，BMSCs在所有微球和支架表面均表现出良好的粘附、铺展和活性，CM经OGP/KLT功能化后显著改善了BMSCs的铺展形态；CCK8实验表明，生物活性肽修饰的微球组BMSCs增殖率更高；微流控芯片制备的BMSCs负载微球中，干细胞存活率高且能正常增殖铺展，SKP的存在进一步增强了其铺展和增殖能力。

（2）BMSCs募集与干性维持

图3. 自组装杂化微球基骨髓模拟微环境中BMSCs的募集和干性。A) 体外骨髓模拟微环境评价的实验组设置示意图；B-E) 无BMSCs组结果：B、C) Transwell迁移图像及结晶紫染色定量BMSC数量；D、E) BMSCs划痕实验图像及迁移率定量；F) 第3天贴壁BMSCs的干性相关基因（Sox2、Klf2、Nanog）表达；G) 第3天贴壁BMSCs的VEGF和IL-10 ELISA检测结果；H) 第3天包裹BMSCs的干性相关基因表达；I) 第3天包裹BMSCs的VEGF和IL-10 ELISA检测结果（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，##p<0.01，###p<0.001，n=3）

Transwell迁移和划痕实验证实，SKP和OGP/KLT均能促进BMSCs迁移，且SKP效果更显著；qRT-PCR结果显示，GM-SKP/CM-OGP/KLT组合对BMSCs干性相关基因（Sox2、Klf2、Nanog）的上调作用最显著；ELISA实验表明，肽修饰微球能显著促进BMSCs分泌VEGF和IL-10等再生因子，且3D包裹的BMSCs响应更显著。该微环境能同时募集内源性BMSCs、维持外源性BMSCs干性，为骨再生早期微环境调控奠定基础。

（3）血管生成能力

图4. 自组装杂化微球基骨髓模拟微环境的血管生成作用。A-E) 无BMSCs组结果：A、B) HUVECs Transwell迁移图像及结晶紫染色定量；C、D) HUVECs划痕实验图像及迁移率定量；E-F) 肽诱导HUVECs管样结构形成的图像及定量；G-H) 贴壁BMSCs条件培养基培养HUVECs的管样结构形成图像及定量；I) 贴壁BMSCs条件培养基培养的HUVECs血管生成相关基因（VEGF、PDGF、FGF、CD31、α-SMA、eNOS）表达；J-K) 包裹BMSCs条件培养基培养HUVECs的管样结构形成图像及定量；L) 包裹BMSCs条件培养基培养的HUVECs血管生成相关基因表达（ns=无显著性差异，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，n=3）

KLT是血管生成的核心肽，能显著促进人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的增殖、迁移和管样结构形成；BMSCs的旁分泌作用与KLT协同，进一步增强血管生成能力；qRT-PCR证实，GM-SKP/CM-OGP/KLT组能显著上调HUVECs的血管生成相关基因表达，3D包裹BMSCs的旁分泌效果更显著，说明该微环境能通过肽释放和干细胞旁分泌双重途径促进血管生成。

（4）免疫调节能力

图5. 自组装杂化微球基骨髓模拟微环境的体外免疫调节特性分析。RAW264.7细胞经LPS预处理后，用不同条件培养基培养：A) LPS组；B) LPS+贴壁BMSCs条件培养基组；D) LPS+包裹BMSCs条件培养基组的流式细胞术分析（F4/80⁺CD206⁺CD86⁺）；C) 流式细胞术定量分析；E) iNOS（M1表型）免疫荧光染色图像；F) CD206（M2表型）免疫荧光染色图像；G) iNOS相对荧光强度定量；H) CD206相对荧光强度定量；I) 贴壁BMSCs条件培养基处理的RAW264.7细胞炎症相关基因表达；J) 包裹BMSCs条件培养基处理的RAW264.7细胞炎症相关基因表达（ns=无显著性差异，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，#p<0.05，####p<0.001，n=3）

经脂多糖（LPS）激活的RAW264.7巨噬细胞在BMSCs条件培养基作用下，M1表型（促炎）标志物iNOS、CD86、TNF-α、IL-6显著下调，M2表型（抗炎）标志物CD206、IL-10显著上调；其中GM-SKP/CM-OGP/KLT组的免疫调节效果最显著，能有效将巨噬细胞从促炎表型极化为抗炎表型，缓解骨再生早期的过度炎症反应，营造利于修复的免疫微环境。

（5）成骨分化能力

图6. 自组装杂化微球基骨髓模拟微环境的体外成骨能力。A) 贴壁BMSCs的ALP染色图像；B) 包裹BMSCs的茜素红（ARS）染色图像；C) 贴壁BMSCs在第7、14天的ALP活性定量；D) 贴壁BMSCs在第21、28天的ARS活性定量；E) 贴壁BMSCs的成骨相关基因（BMP、ALP、RUNX2、OSX、OCN、OPN、PPARγ）表达；F) 包裹BMSCs的ALP染色图像；H) 包裹BMSCs在第7、14天的ALP活性定量；I) 包裹BMSCs在第21、28天的ARS活性定量（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，#p<0.05，####p<0.001，n=3）

早期SKP主要维持干细胞干性，对成骨分化有轻微抑制，而OGP/KLT能显著促进BMSCs的碱性磷酸酶（ALP）活性和矿化结节形成；第14天后，SKP与OGP/KLT协同作用，显著上调成骨相关基因（RUNX2、OSX、OCN、OPN等）表达；GM-SKP/CM-OGP/KLT组合的成骨分化效果最优，且3D包裹的BMSCs成骨潜能更显著；GM在28天近完全降解，使BMSCs能与周围组织相互作用，启动原位成骨。

3.4 体内动物实验验证

构建大鼠股骨髁3mm×3mm×4mm临界骨缺损模型，设置四组实验：①对照组（仅3D打印支架）；②MS组（支架负载GM/CM微球，无肽）；③MSP组（支架负载GM-SKP/CM-OGP/KLT微球，无外源性BMSCs）；④MSPC组（支架负载GM-SKP/CM-OGP/KLT微球，负载外源性BMSCs），通过免疫组织化学、Micro-CT、组织学染色验证骨再生效果。

（1）早期干细胞募集与免疫调节

图7. 杂化微球基骨髓模拟微环境体内1周BMSCs募集和炎症效应的免疫组化染色分析。A) 体内实验组设置示意图；B) CD90免疫组化染色图像；C) iNOS免疫组化染色图像；D) CD206免疫组化染色图像；E) CD90阳性表达率定量；F) iNOS阳性表达率定量；G) CD206阳性表达率定量；H) CD206/iNOS阳性率比值定量（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，####p<0.001，n=3）

术后1周，CD90（干细胞标志物）免疫组化显示，MSPC组的干细胞募集量最多，微球为干细胞提供了额外的粘附位点；iNOS（M1）表达显著降低，CD206（M2）表达显著升高，MSPC组的CD206/iNOS比值最高，说明该骨髓模拟微环境能有效募集内/外源性干细胞，缓解早期炎症反应，为骨再生奠定基础。

（2）骨再生的Micro-CT分析

图8. 杂化微球基骨髓模拟微环境修复股骨髁缺损12周的Micro-CT分析。A) Micro-CT 3D重建图像（红圈为缺损区）；B) 缺损区横截面图像；C) 缺损区3D重建图像（绿色为支架，蓝色为骨组织，白圈为支架孔隙内新生骨）；D) 骨体积分数（BV/TV）定量；E) 骨小梁数量（Tb.N）定量；F) 骨小梁厚度（Tb.Th）定量；G) 骨小梁分离度（Tb.Sp）定量；H) 各实验组调控骨髓微环境中BMSCs的关系示意图（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，#p<0.05，####p<0.001，n=3）

术后12周，Micro-CT结果显示：对照组几乎无新生骨形成，MS组有少量新生骨，MSP组新生骨显著增加，MSPC组支架孔隙内几乎被新生骨完全填充；定量分析显示，MSPC组的BV/TV、Tb.N、Tb.Th均为最高，Tb.Sp为最低，骨再生效果最优，证实骨髓模拟微环境能显著促进临界骨缺损的骨再生，且外源性BMSCs与内源性募集的干细胞协同作用进一步提升修复效果。

（3）成骨与血管生成的组织学分析

图9. 杂化微球基骨髓模拟微环境的成骨和血管生成效果分析。A) 12周各实验组H&E染色图像（红圈为支架柱旁再生区放大视野）；B) 12周各实验组Masson染色图像；C) 1周CD31免疫组化染色图像；D) 12周CD31+Emcn+H型血管免疫荧光染色图像（红箭头为H型血管）

HE、Masson、Goldner三色染色显示，MSPC组的新生骨和血管网络最丰富，支架孔隙内几乎被新生骨填充；术后1周CD31免疫组化显示，MSPC组的血管密度显著高于其他组；术后12周H型血管（CD31+Emcn+，功能性成骨血管）免疫荧光显示，MSPC组的H型血管表达最广泛，证实该微环境能促进功能性血管生成，并与成骨过程协同，实现血管化骨再生。

此外，主要脏器（肝、肾、脾）的H&E染色显示，所有实验组均无组织坏死、炎症浸润等病理改变，证实该材料系统具有优异的体内生物相容性，无全身毒性。

三、研究结论

本研究成功制备了负载BMSCs的GM-SKP快速降解释球和负载OGP/KLT的CM-OGP/KLT缓慢降解释球，两种微球通过静电作用自组装形成杂化体系，与3D打印PLGA/HA支架结合构建了骨髓模拟微环境，该体系在体外和体内实验中均表现出优异的骨再生调控能力。

该骨髓模拟微环境能精准匹配骨再生的动态过程：早期通过SKP实现内源性BMSCs募集，同时维持外源性BMSCs的干性，促进抗炎巨噬细胞极化，缓解过度炎症反应，营造利于修复的微环境；后期通过OGP/KLT的持续释放，促进功能性血管生成（包括H型血管）和BMSCs的成骨分化，最终在大鼠股骨髁临界骨缺损模型中形成原位成骨中心，显著提升骨再生效果。

该研究构建的骨髓模拟微环境结合了干细胞募集/负载、生物活性肽时序释放、免疫调节、血管生成与成骨分化的协同调控，为骨组织工程和干细胞治疗提供了新的思路和策略，有望成为临界骨缺损修复的有效方法。

4.1 研究创新点

• 首次将两种不同降解速率的水凝胶微球结合，实现生物活性肽的时序释放，精准模拟骨髓的再生微环境；
• 整合内源性干细胞募集和外源性干细胞负载，解决了骨髓中BMSCs浓度低的问题，实现干细胞的高效富集；
• 实现了免疫调节、血管生成、成骨分化的多维度协同调控，构建了适合骨再生的全周期微环境；
• 杂化微球具有可注射性，与3D打印支架结合后兼具生物活性和力学稳定性，临床转化潜力大。

4.2 研究局限性与未来方向

本研究虽取得了良好的骨再生效果，但仍存在一定局限性，未来需进一步研究：

• 模拟的骨髓微环境缺乏造血干细胞（HSCs）及相关生长因子，未来可引入HSCs增强旁分泌成骨作用；
• 未系统评估生物活性肽的最优浓度，未来需探究肽的最佳浓度和协同作用规律；
• 3D打印PLGA/HA支架降解速率较慢，残留材料可能影响骨重塑，未来需优化支架的成分和孔隙率，实现支架降解与骨再生的同步；
• 未完全阐明肽调控干细胞干性和成骨分化的具体信号通路，未来需开展深入的机制研究；
• 目前仅在大鼠模型中验证，未来需在大动物模型中进一步验证，为临床转化提供更充分的依据。