一、研究背景

脑血管狭窄相关疾病（如动脉粥样硬化、缺血性中风、烟雾病）因病变区域复杂性和重要性，给临床治疗带来巨大挑战。目前的血管重建、血管成形术等治疗手段难以复刻脑血管的复杂结构和动态血流环境，导致治疗效果受限，因此亟需构建精准、功能性的体外狭窄脑血管模型，用于疾病机制研究和治疗方案开发。

芯片器官平台虽为血管疾病研究提供了工具，但传统微流控系统的通道几何结构可扩展性有限，无法复现异常血管结构中的血流扰动等病理特征，难以研究复杂的血流动力学。3D生物打印技术成为制备解剖学相关狭窄血管模型的理想方案，其中3D同轴生物打印可精准制备多层复杂血管结构，能几何保真复刻血管管腔和周围组织，契合脑血管研究需求。

脱细胞细胞外基质（dECM）基生物墨水因保留天然ECM成分，成为血管组织打印的热门材料，但脱细胞过程会导致ECM成分部分流失，生物活性和机械稳定性受损。因此，需对dECM进行功能化改性，结合其他生物材料提升其机械性能和打印适用性，为3D同轴生物打印提供高性能生物墨水。

二、研究内容

本研究开发了一种基于机械增强的血管脱细胞外基质（VdECM）杂化生物墨水的嵌入式3D同轴生物打印技术，构建体外狭窄脑血管模型，探究血流动力学力诱导的内皮细胞炎症反应，核心研究内容分为4个部分：

2.1 杂化VdECM生物墨水的开发与表征

以猪主动脉为原料制备VdECM，通过理化脱细胞工艺去除细胞成分（DNA含量降至50ng/mg以下），同时保留糖胺聚糖（GAGs）、胶原蛋白、弹性蛋白等关键ECM成分（弹性蛋白含量因细胞成分去除相对升高）。

图2 血管组织来源脱细胞外基质（VdECM）水凝胶的开发。a,b) 理化脱细胞工艺制备VdECM水凝胶：猪血管组织切碎→洗涤剂处理→冻干→酸溶获得VdECM粉末及生物墨水；c) 天然组织与VdECM的生化成分定量分析：(i)DNA含量(n=4)、(ii)GAGs含量(n=3)、(iii)胶原蛋白含量(n=3)、(iv)弹性蛋白含量(***,p≤0.001；**,p≤0.01；*,p≤0.05)；d) 苏木精-伊红、Masson三色、Verhoeff-Van Gieson染色的组织学对比（比例尺100μm）

为解决纯VdECM机械性能差、易收缩的问题，添加胶原蛋白减少水凝胶收缩，添加海藻酸钠实现快速离子交联并维持结构稳定性，制备杂化生物墨水（1V2C1A：1%VdECM+2%胶原蛋白+1%海藻酸钠）。

图3 VdECM生物墨水与杂化生物墨水性能对比。a) 两种生物墨水机械性能差异示意图；b) 不同浓度VdECM水凝胶的收缩性视觉观察(n=3；***,p≤0.001；**,p≤0.01；ns,无显著性)；c) 基于VdECM和杂化生物墨水的浴中3D同轴生物打印；d-g) 不同条件下生物墨水动态力学性能的流变学结果；h) 杂化生物墨水与VdECM主导生物墨水的活/死染色及细胞增殖（比例尺100μm；n=3；*,p≤0.05；ns,无显著性）

流变学测试表明，杂化生物墨水具有剪切稀化特性（可打印性）、快速力学恢复能力（适合嵌入式打印），动态模量提升约65倍；拉伸/压缩模量显著高于纯VdECM，且细胞存活率保持90%以上，兼顾机械性能和生物相容性。

2.2 狭窄血管的尺寸精准调控与制备

优化3D同轴生物打印参数，通过调控打印平台移动速度精准控制血管管腔直径和壁厚：平台速度从400mm/min提升至1200mm/min，管腔内径从1340.0±0.12μm降至551.30±1.23μm，壁厚保持11-14μm的薄壁厚，支持内皮单层形成。

图4 打印参数优化制备狭窄血管结构。a) 打印平台速度改变调控血管直径的示意图；b) 脑血管制备的浴中3D同轴生物打印装置；c) 调整平台速度获得可控内径和壁厚的可灌注血管导管（比例尺1mm；n=3）；d) 瞬时速度变化制备狭窄血管（比例尺1mm）；e) 打印血管导管的3D可视化，显示可灌注管腔结构

通过将打印平台速度临时提升至3600mm/min，成功制备狭窄区域管腔直径减半的脑血管模型，模拟动脉粥样硬化（狭窄率超75%）的病理特征，且模型可实现无堵塞的连续液体灌注。

2.3 功能性脑血管的生物打印与内皮屏障表征

将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和人脑微血管内皮细胞（HBMECs）负载于杂化生物墨水，打印构建脑血管芯片模型，培养基通过针锚定孔直接灌注至血管壁，支持内皮细胞培养。

图5 功能性脑血管的3D同轴生物打印。a) 适用于多种培养体系的成熟脑血管芯片平台示意图；b) 支持静态/动态培养的脑血管构建平台；c) 负载GFP标记的HUVECs和HBMECs的生物打印血管培养7天（比例尺100μm）；d) 活/死染色显示内皮细胞存活率超90%(n=5；****,p≤0.001)；e-g) 连接标记物（CD31、ZO-1、VE-钙粘蛋白）的表达，表明内皮屏障完整性（e比例尺200μm；f,g比例尺50μm）；h) 70kDa FITC标记葡聚糖的通透性测试（比例尺200μm；n=3；**,p≤0.01；ns,无显著性）；i) 不同分子的尺寸依赖性通透性分析(n=3；***,p≤0.001；ns,无显著性)

培养7天后内皮细胞形成融合的单层结构，存活率超97%，且高表达CD31、ZO-1、VE-钙粘蛋白等连接蛋白，表明形成成熟的内皮屏障；通透性测试显示，HBMECs构建的模型屏障功能优于HUVECs，且具有尺寸依赖性通透性（小分子通透性高于大分子），符合脑血管的生理特征。

2.4 狭窄脑血管的血流动力学响应研究

结合计算流体动力学（CFD）模拟和体外实验，分析狭窄脑血管的血流动力学特征：在3mL/min入口流量下，狭窄区域出现低壁面剪切应力、血流再循环的紊乱流型，与模拟结果一致。

图6 生物打印狭窄脑血管的血流动力学响应。a) 脑血管疾病建模流程示意图；b) 浴中3D同轴生物打印制备的狭窄脑血管（比例尺200μm）；c) 表达CD31的成熟内皮（比例尺100μm）；d) CFD模拟分析壁面剪切应力和流体流速；e) 荧光微球可视化流体流型，验证狭窄病变处的血流动力学变化（比例尺500μm）；f,g) 紊乱流条件下细胞粘附分子表达增加（ICAM-1(n=3)、VCAM-1(n=4)）（比例尺100μm；***,p≤0.001；*,p≤0.05）

紊乱血流刺激下，狭窄区域内皮细胞的炎症标记物ICAM-1（约2.2倍）、VCAM-1（约1.5倍）显著上调，证实血流动力学应力可诱导脑血管内皮炎症反应，成功复现脑血管狭窄的关键病理特征。

图1 使用生物3D打印机同轴打印模块制备狭窄脑血管模型的整合方法。生物工程血管模型在结构和生物学上复刻脑动脉粥样硬化的狭窄区域，血管狭窄破坏血流；模型中成熟内皮模拟脑血管完整性和流体刺激下的内皮反应；结合流体速度、壁面剪切应力、紊乱流型等血流动力学参数的CFD模拟，诱导紊乱流引发内皮功能障碍，模拟包括粘附分子表达在内的病理反应；该平台可为疾病机制研究和治疗策略开发提供支持

三、研究结论

1. 成功开发了VdECM-胶原蛋白-海藻酸钠杂化生物墨水，通过机械增强改性，其动态模量提升约65倍，兼具优异的打印性、结构稳定性和生物相容性，细胞存活率保持90%以上，为脑血管3D生物打印提供了理想材料。

2. 优化了嵌入式同轴生物3D打印参数，可通过调控打印平台速度实现250-500μm管腔直径的狭窄脑血管精准制备，模型可实现无堵塞的连续灌注，成功复现动脉粥样硬化的血管狭窄病理特征。

3. 生物打印的狭窄脑血管可形成成熟、功能性的内皮屏障，内皮细胞高表达连接蛋白，具有尺寸依赖性通透性，人脑微血管内皮细胞构建的模型更贴合脑血管的生理屏障特征。

4. CFD模拟和体外实验证实，狭窄脑血管的紊乱血流会诱导ICAM-1、VCAM-1炎症标记物上调，成功复现血流动力学力介导的内皮炎症反应，构建的体外模型具有良好的生理相关性。

5. 该3D同轴生物打印技术为脑血管疾病体外建模提供了新方法，可用于探究脑血管狭窄的疾病机制、开展药物筛选和个性化医疗研究，为脑血管疾病的治疗创新奠定基础。

四、论文基础信息