一、研究背景
骨肉瘤是一种高度恶性的骨肿瘤，主要发生于儿童和青少年，好发于长骨，具有侵袭性强的特点，可造成骨破坏、剧烈疼痛、残疾甚至远处转移，临床需结合系统药物和外科手术干预。目前临床主流的保肢治疗包括肿瘤完整切除、骨缺损重建以及放化疗辅助治疗，理想状态下可同时清除肿瘤并恢复肢体功能，但骨肉瘤普遍存在的放化疗耐药性，难以实现镜下切缘阴性（R0）切除，易导致局部复发、保肢失败，往往需要二次或多次侵入性手术，严重影响患者预后。
3D打印仿生复合支架为骨肉瘤保肢治疗提供了新策略，其中羟基磷灰石（HA）、β-磷酸三钙等磷酸钙陶瓷支架因与天然骨矿物成分相似、生物相容性好、具有骨传导和骨诱导性，成为骨移植的重要替代材料。但骨肉瘤侵袭、肿瘤代谢引发的过度骨溶解及手术切除，会造成骨缺损微环境再生性差，超出支架固有修复能力；现有支架改性策略（整合生物活性因子、干细胞）虽一定程度克服该问题，却无法同时实现肿瘤杀伤与骨再生、缺乏智能微环境适应性，且材料设计复杂、再生效率不足。
骨肉瘤复发或保肢术后炎性创伤会导致缺损区H₂O₂水平显著升高、形成缺氧微环境，破坏氧化还原稳态，对内生干细胞造成持续性氧化应激，严重阻碍骨再生。理想的骨缺损修复材料需实现H₂O₂的智能催化：在肿瘤微环境中转化为高毒性活性氧（ROS）诱导肿瘤细胞凋亡，在炎性骨缺损微环境中分解为O₂缓解炎症、恢复成骨-破骨平衡。现有纳米酶类生物催化材料（金属氧化物、贵金属纳米颗粒）难以同时实现H₂O₂向ROS和O₂的智能转化，且现有治疗策略仅聚焦抗肿瘤或抗炎单一功能，尚无针对骨肉瘤保肢治疗的多效生物催化材料，因此开发可智能根除肿瘤、重塑氧化还原稳态的通用型生物催化材料成为保肢治疗的关键需求。
二、核心研究内容
本研究首次设计并构建了超声激活型生物催化纳米颗粒修饰的3D打印羟基磷灰石支架（HS-ICTO），通过TiO₂纳米材料为半导体基底，构建Ti-O-Ir电子耦合结构的Ir簇（ICTO），实现H₂O₂的时空可控催化，在骨肉瘤微环境中高效生成ROS杀伤肿瘤，在骨缺损微环境中分解H₂O₂生成O₂促进骨再生，完成“肿瘤根除-骨缺损修复”的智能序贯治疗，同时验证了该支架的体外抗肿瘤、抗氧化应激、抑制破骨形成及体内肿瘤清除、骨缺损重建效果，并阐明了其催化机制。
2.1 HS-ICTO支架的制备与结构表征
采用湿蒸发沉积法将ICTO纳米颗粒负载于3D打印HA支架（HS）表面，制备不同ICTO浓度的HS-ICTO-x支架（x=0、0.5、1.0、2.0 mg/mL）。通过场发射扫描电镜（FESEM）、能谱仪（EDS）、X射线衍射（XRD）、透射电镜（TEM）、X射线光电子能谱（XPS）、X射线吸收光谱（XAS）等手段表征支架结构，结果显示：ICTO以平均1.7 nm的Ir簇高度分散于TiO₂表面，形成Ti-O-Ir强化学耦合和界面电荷转移；HS-ICTO保留了HS的互锁交织多孔结构，Ti、Ir、Ca、P、O元素均匀分布，且ICTO负载未改变HS的力学性能（抗压强度2.02±0.15 MPa），与人体松质骨相当，ICTO纳米颗粒在支架表面稳定性好，仅在机械刮擦或外部能量干扰下发生脱落。
图2 | HS-ICTO的形貌和结构表征。a：HS-ICTO支架从毫米到原子尺度的结构示意图（灰色：O；青色：Ti；黄色：Ir）；b：HS-ICTO的代表性SEM图；c、d：HS-ICTO的高倍SEM图；e：ICTO的TEM图；f：ICTO的EDS元素mapping；g：ICTO的高分辨TEM图；h：ICTO的超高倍TEM图；i：ICTO的HAADF-STEM图及对应的FFT图谱；j：ICTO和Ir/C在Ir 4f区的XPS谱；k：ICTO和TO在Ti 2p区的XPS谱；l：Ir L3边的归一化XANES谱；m：Ir L边EXAFS谱的k³加权傅里叶变换谱；n：k³加权EXAFS信号的小波变换图。R为吸附原子与相邻原子的距离，χ(k)为EXAFS振荡振幅随光电子波数k的变化，颜色梯度从橙色（高信号强度）到青色（低信号强度）。
2.2 ICTO的多酶样催化活性及机制
ICTO因分级花瓣状纳米片结构、高比表面积，实现了H₂O₂底物高可及性和超声能量高效吸收，具有**过氧化物酶（POD）、氧化酶（OXD）、过氧化氢酶（CAT）样三重酶活性**，且催化活性具有pH依赖性：
-
在肿瘤微环境的弱酸性条件下（pH≈6.5），ICTO通过POD/OXD样途径结合超声激活，快速生成大量ROS（主要为·O₂⁻和¹O₂），同时高效消耗谷胱甘肽（GSH），破坏肿瘤细胞氧化还原稳态；其催化动力学参数优于纯TiO₂及多数已报道的POD模拟酶（Vmax=3.51×10⁻⁷ M s⁻¹，TON=21.60×10⁻³ s⁻¹，Km=0.655 mM）。
-
在骨缺损的中性条件下（pH≈7.4），ICTO表现出高效CAT样活性，20分钟内可清除约90%的H₂O₂并持续生成O₂，动力学参数优异（Vmax=48.23 μM s⁻¹，TON=4.11 s⁻¹），且长期催化活性稳定，无明显性能衰减。
通过密度泛函理论（DFT）计算阐明催化机制：Ti-O-Ir界面的电子转移是多酶活性的核心，Ti位点优化氧中间体吸附，Ir位点为活性中心；POD样反应的决速步为·OOH形成（能垒0.51 eV），需酸性环境提供H+，而CAT样反应的决速步为O₂和H₂O解吸（能垒0.34/0.38 eV），在中性条件下可自发进行；Ir-OH的电子态更活跃，与H₂O₂的反应性高于Ti-OH，实现了H₂O₂的pH响应性智能催化。
图3 | ICTO的酶样生物催化活性及理论计算。a：ICTO的结构优势及多酶样催化活性示意图；b：TMB法检测ICTO和TO的POD/OXD样活性（λ=652 nm）；c：ICTO和TO的催化动力学参数对比；d：DTNB法检测ICTO的GSH消耗能力；e：DMPO捕获·O₂⁻、TEMP捕获¹O₂的EPR谱；f：中性条件下ICTO和TO的H₂O₂清除及O₂生成能力；g：ICTO和TO的CAT样动力学参数对比；h：ICTO上POD/CAT样催化的反应路径；i：对应的吉布斯自由能图；j：ICTO中Ir-OH和Ti-OH的O 2p轨道投影态密度（PDOS）；k：ICTO*2OH的差分电荷密度分析（青色=电荷耗尽，黄色=电荷积累）；l：ICTO中Ir-OH和Ti-OH的Bader电荷计算。Vmax=最大反应速率，Km=米氏常数，TON=转化数。
2.3 HS-ICTO的体外抗肿瘤效果
体外细胞实验以143b人骨肉瘤细胞、大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）为模型，验证HS-ICTO的生物相容性和抗肿瘤活性：
-
生物相容性：ICTO和TO在150 μg/mL浓度下对中性条件下的BMSCs无明显细胞毒性，细胞活力＞95%；
-
靶向抗肿瘤：弱酸性肿瘤微环境中，150 μg/mL ICTO可将143b细胞活力降至45.3%，HS-ICTO-2.0结合超声（1 W/cm²，1.0 MHz，30%占空比，1 min）后，143b细胞活力仅剩余9.7%；
-
作用机制：HS-ICTO在肿瘤微环境中生成大量ROS，结合超声激活实现ROS爆发，同时消耗GSH、缓解肿瘤缺氧（下调HIF-1α表达），破坏线粒体膜电位、引发线粒体肿胀裂解，最终诱导肿瘤细胞凋亡；RNA-seq结果显示，HS-ICTO+超声处理后，骨肉瘤细胞中凋亡、ROS损伤、应激反应相关基因显著上调。
图4 | 体外骨肉瘤根除治疗效果。a：TME条件下HS-ICTO的治疗机制示意图；b：TMB法检测HS-ICTO-x的POD样活性；c：HS-ICTO的超声激活生物催化氧化TMB和DPA效果；d：不同处理组细胞的PCA分析；e：HS-ICTO+US vs HS、HS-ICTO vs HS的差异基因火山图；f：143b细胞中与ROS损伤、应激反应、凋亡相关的差异基因GO富集分析；g：不同处理后支架表面143b细胞的活/死染色共聚焦图及3D重建；h：Annexin V-FITC/PI染色的流式细胞术凋亡分析；i：不同支架上143b细胞的HIF-1α蛋白表达Western blot检测。
2.4 HS-ICTO的体内抗肿瘤效果
构建143b骨肉瘤裸鼠皮下移植瘤模型，将HS、HS-ICTO支架植入肿瘤组织，术后24/48/72 h给予局部超声照射（2.5 W/cm²，1 MHz，30%占空比，5 min），结果显示：
-
HS-ICTO+超声组的肿瘤抑制率高达90.43%，显著优于单纯HS、HS+超声、单纯HS-ICTO组；
-
组织学检测：HS-ICTO+超声组肿瘤组织出现核固缩、胞质缩小、组织结构破坏，TUNEL阳性细胞数显著增加，Ki67阳性增殖细胞数显著减少，caspase-3活化凋亡细胞几乎占据全部肿瘤组织；
-
生物安全性：各组小鼠体重无明显变化，主要脏器H&E染色无异常，溶血实验、大鼠皮下植入后的血常规及肝肾功能检测均在正常范围，证实HS-ICTO无明显体内毒性。
图5 | 体内骨肉瘤移植瘤杀伤效果。a：143b骨肉瘤移植瘤模型建立及治疗流程；b：HS-ICTO根除骨肉瘤的机制示意图；c：第15天肿瘤切除后的实物图；d：每3天记录的肿瘤体积变化；e：第15天肿瘤重量；f：肿瘤生长抑制率；g：小鼠体重变化热图；h：肿瘤组织的H&E、TUNEL、Ki67荧光染色；i：TUNEL阳性细胞数定量分析；j：Ki67染色平均荧光强度（MFI）定量分析。
2.5 HS-ICTO的氧化还原稳态调控与干细胞保护
以H₂O₂诱导的BMSCs氧化应激模型验证HS-ICTO对骨再生相关干细胞的保护作用，结果显示：
-
HS-ICTO可高效清除缺损区过量H₂O₂并持续生成O₂，且清除能力与ICTO负载量正相关，4周模拟生理条件下催化活性稳定；
-
细胞保护：H₂O₂刺激下，HS组BMSCs出现活力下降、铺展面积减小、迁移能力降低，内质网扩张、线粒体肿胀，而HS-ICTO组BMSCs的活力、铺展形态、迁移能力均无明显受损，细胞器结构完整；
-
成骨保护：H₂O₂显著抑制HS组BMSCs的碱性磷酸酶（ALP）活性和钙沉积，下调成骨相关基因（Runx2、BMP-2、COLI、ALP）和蛋白表达；而HS-ICTO可逆转该抑制作用，维持BMSCs的成骨分化能力，实现氧化应激下的成骨保护。
图6 | 体外氧化还原稳态调控与氧化应激下的干细胞保护。a：骨缺损条件下HS-ICTO恢复H₂O₂氧化还原稳态及缓解缺氧的示意图；b：HS和HS-ICTO-x的H₂O₂时间依赖性清除能力；c：HS和HS-ICTO-x的O₂生成能力；d：第5天不同处理支架上BMSCs的活/死染色共聚焦图及CCK-8检测结果；e：不同处理后BMSCs的鬼笔环肽染色共聚焦图及细胞大小定量；f：不同处理后BMSCs的TEM观察（红色箭头=线粒体损伤，红色星号=内质网肿胀）；g：成骨诱导14天的ALP染色；h：成骨诱导21天的茜素红（ARS）染色；i：ALP阳性面积定量；j：ARS阳性面积定量；k：成骨诱导14天Runx2、BMP-2、COLI的免疫荧光染色；l：免疫荧光染色MFI定量；m：成骨诱导14天成骨相关基因的RT-qPCR检测；n：HS-ICTO调控H₂O₂氧化还原稳态保护BMSCs的示意图。
2.6 HS-ICTO的破骨形成抑制作用
骨肉瘤相关骨破坏与破骨细胞过度活化相关，以K7M2小鼠骨肉瘤细胞与RAW264.7小鼠巨噬细胞共培养模型、RANKL诱导的RAW264.7破骨分化模型验证HS-ICTO的抗破骨效果：
-
骨肉瘤细胞可显著上调破骨相关基因（NFATc1、MMP-9、ACP5、c-Fos）表达，促进破骨细胞分化；
-
HS-ICTO可显著抑制RANKL诱导的RAW264.7形成肌动蛋白环（破骨细胞特征形态），减少TRAP阳性破骨细胞数量，下调破骨相关基因和蛋白（HIF-1α）表达；
-
作用机制：HS-ICTO通过清除H₂O₂、生成O₂，抑制H₂O₂/HIF-1α依赖的破骨分化信号通路，实现“清除ROS+缓解缺氧”双重抗破骨效果，减少骨吸收、利于骨缺损修复。
图7 | HS-ICTO的破骨形成抑制作用。a：K7M2与RAW264.7细胞的Transwell共培养实验示意图；b：共培养7天后RAW264.7破骨相关基因的RT-qPCR检测；c：HS-ICTO抑制破骨形成的机制示意图；d：不同处理后RAW264.7的肌动蛋白环/DAPI染色；e：破骨细胞大小定量；f：不同处理后RAW264.7的TRAP染色；g：TRAP阳性细胞数定量；h：不同处理7天后破骨相关基因的RT-qPCR检测；i：RAW264.7的HIF-1α蛋白表达Western blot检测。PC=阳性对照组（仅50 ng/mL RANKL刺激）。
2.7 HS-ICTO的体内骨缺损重建效果
构建大鼠颅骨缺损模型（φ=5 mm），左侧植入HS、右侧植入HS-ICTO，分别在4/8/12周进行影像学和组织学检测，结果显示：
-
RNA-seq结果：HS-ICTO组缺损区炎症反应、骨吸收、ROS应激、缺氧相关基因显著下调，氧化还原稳态和骨再生微环境得到改善；
-
组织学检测：4/8周时HS-ICTO组缺损区有更多未成熟胶原沉积和新骨形成，12周时支架内部被新生骨完全填充，而HS组仍有大量未成熟胶原；
-
Micro-CT检测：HS-ICTO组的骨体积/组织体积比（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）、骨密度（BMD）均显著高于HS组，骨小梁分离度（Tb.sp）显著降低；
-
成骨相关检测：HS-ICTO组缺损区Runx2、BMP-2阳性细胞比例显著高于HS组，TRAP阳性破骨细胞数量显著减少，实现成骨-破骨平衡重塑。
图8 | 大鼠颅骨缺损模型的体内骨再生效果。a：体内骨再生评估流程示意图；b：不同样本的PCA分析；c：缺损区骨组织中与ROS损伤、骨破坏、炎症相关的差异基因GO富集分析；d：差异基因表达热图；e：不同支架诱导再生骨的H&E染色；f：Masson三色染色；g：缺损区的Micro-CT冠状面图；h：骨体积（BV/TV）定量分析；i：骨小梁数量（Tb.N）定量分析；j：不同支架的Runx2/BMP-2/COLI免疫荧光染色；k：Runx2阳性细胞比例定量；l：BMP-2阳性细胞比例定量。
