一、研究背景

骨软骨（OC）缺损由创伤、退行性关节疾病或感染引发，因同时涉及关节软骨和软骨下骨，是骨科领域的重大挑战。软骨无血管的特性以及骨软骨界面复杂的生物力学特征，严重限制了机体自身的修复机制，常导致疼痛、功能障碍，甚至发展为骨关节炎。

当前的临床策略，如微骨折、自体移植/异体移植以及细胞疗法等，均未能实现骨软骨修复所需的结构与功能整合，无法达成持久修复的效果，因此迫切需要创新的解决方案。传统的骨软骨修复支架策略，例如模拟软骨和骨层的双层设计，往往存在力学不匹配、界面整合性差以及孔隙梯度不合理等问题，进而导致载荷传递不佳和细胞浸润受限。

天然生物材料虽具有生物相容性和类细胞外基质特性，但在承重区域面临降解速度快、机械稳定性不足等局限；合成聚合物和陶瓷材料虽可调节降解性能和强度，却存在生物惰性，需要进行表面修饰或添加生长因子。组织工程学致力于开发能够仿生复制天然骨软骨组织层级结构和生化信号的支架，为解决这一难题提供了变革性思路。

二、研究内容

（一）材料与方法

1. 实验材料：采用聚乙烯醇（PVA）、甘油（GC）、kartogenin（KGN）、纳米羟基磷灰石（nHA）、75%乙醇以及聚环氧乙烷（PEO）作为生物墨水成分，所有材料均未经过进一步纯化处理。

2. 3D打印墨水制备：

• 纳米多孔层水凝胶（NPH）：将2g PVA与不同浓度（0-100μM）的KGN溶解在18.0g GC/水二元溶液（质量比1:1）中，在95℃搅拌至PVA完全溶解，静置去除气泡。
• 分层多孔层水凝胶（HPH）：先将2g PVA、0.4g PEO溶解在18.0g GC/水二元溶液（质量比1:1）中，再加入不同含量（0-30wt%）的nHA，95℃搅拌至完全溶解，静置30分钟去除气泡，倒入矩形玻璃模具，-20℃放置1小时制备样品。

3. 3D打印过程：使用自制3D打印机（喷嘴直径250μm）打印NPH、HPH和THMH支架。THMH支架经一步冻融循环（-20℃ 6小时，25℃ 4小时）和75%乙醇处理2小时，去除PEO和过量甘油，得到最终支架。

4. 表征方法：通过扫描电子显微镜（SEM）、光学显微镜、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）、动态流变分析、拉伸、压缩、弯曲及循环拉伸测试等对支架的形貌、结构、力学性能进行表征。

5. 细胞实验：培养骨髓间充质干细胞（BMSCs），通过CCK-8法、活死细胞染色评估支架生物相容性；采用碱性磷酸酶（ALP）染色、茜素红（AR）染色、实时聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫荧光染色等检测支架对BMSCs成骨和成软骨分化的影响；进行转录组测序分析差异表达基因及相关信号通路。

6. 动物实验：将64只6-8周龄雄性SD大鼠随机分为4组（NPH、HPH、THMH和空白组），在股骨髁建立骨软骨缺损模型（直径2mm×深度3mm），植入相应支架或不做处理。术后6周和12周处死大鼠，通过大体观察、Micro-CT扫描、组织学染色（HE、番红O-固绿、免疫组织化学、免疫荧光染色）、序列荧光染色等评估骨软骨修复效果；进行有限元分析评估生物力学性能；检测主要器官组织评估体内生物相容性。

（二）核心研究设计

本研究开发了一种拓扑分层机械水凝胶（THMH）支架，采用集成3D打印技术，具有仿生双层结构，能够模拟天然骨软骨微环境。该支架整合了纳米多孔软骨模拟层和大孔成骨层，通过梯度孔隙相互连接，以促进营养物质运输、血管形成和细胞间通讯。

PVA被选为支架基质，因其具有良好的生物相容性、可调节的物理交联特性和灵活的拓扑结构控制能力。THMH的力学异质结构实现了无缝的力学过渡，类似天然骨软骨界面，其纳米孔（85±28nm）用于营养交换和生长因子保留，大孔（324±37μm）用于细胞迁移和血管形成。

图1. THMH用于加速骨软骨再生的集成3D打印示意图

（三）关键实验结果

1. 结构与力学性能：SEM图像显示THMH具有层级多孔结构，界面结合牢固；FTIR和XRD证实KGN和nHA成功整合到支架中；动态力学分析表明纳米多孔层具有更高的储能模量和损耗模量；力学测试显示THMH具有良好的弹性、拉伸强度（1.9±0.3MPa）、断裂伸长率（308±27%）和抗疲劳性能，在100次循环拉伸后仍保留90.6%的原始强度。

图2. （A）THMH集成3D打印的数字照片；（B）THMH的垂直截面SEM照片；（C）（B）的放大SEM照片；（D）（B）的放大SEM照片；（E，F）3D打印NPH的表面SEM照片；（G，H）3D打印HPH的表面SEM照片；（I）弯曲、拉伸和扭转过程中的数字照片；（J）纳米多孔层、分层多孔层和THMH的FTIR曲线；（K）纳米多孔层、分层多孔层和THMH的XRD曲线；（L）NPH、HPH和THMH的储能模量和损耗模量

图3. （A）KGN释放标准曲线；（B）24天的KGN长期释放测试；（C）KGN负载效率；（D）NPH、HPH和THMH不同水凝胶的溶胀率；（E）NPH、HPH和THMH的孔隙率；（F）NPH、HPH和THMH的应力-应变曲线；（G）NPH、HPH和THMH的应力-应变曲线；（H）NPH、HPH和THMH的强度；（I）NPH、HPH和THMH的压缩模量

2. 体外生物性能：CCK-8法和活死细胞染色证明THMH具有优异的生物相容性；Alcian蓝染色、RT-PCR和免疫荧光染色显示NPH层能显著促进BMSCs成软骨分化，抑制软骨肥大分化；ALP染色、AR染色、RT-PCR和免疫荧光染色表明HPH层可有效促进BMSCs成骨分化。

图4. （A）BMSCs与NPH、HPH和THMH共培养1、4或7天的CCK-8测定；（B）不同水凝胶共培养7天后，用钙黄绿素-AM（活细胞，绿色荧光）和PI（死细胞，红色荧光）染色的BMSCs的CLSM图像（比例尺100μm）；（C）第7天的ALP染色和ALP活性测量（比例尺100μm，***p<0.001）；第14天的茜素红染色（ARS）和定量分析（比例尺200μm，***p<0.001）；（D）第14天各组BMSCs的成骨基因表达（OPN、OCN、RUNX2和BMP2）（***p<0.001）；（E）第14天的阿尔新蓝染色和定量分析（比例尺100μm，***p<0.001）；（F）第14天各组BMSCs的软骨相关基因表达（AGG、SOX9、COLII和MMP13）（***p<0.001）

3. 转录组分析：NPH组差异表达基因富集于机械刺激响应、细胞增殖迁移粘附正调控、细胞外基质组织及PI3K-AKT信号通路，提示其通过力学性能和KGN激活整合素-PI3K-AKT信号轴促进成软骨分化；HPH组差异表达基因富集于细胞粘附增殖、细胞外基质组织、缺氧响应及BMP信号通路，其层级多孔结构改善了内部缺氧环境，促进成骨分化。

图7. （A）在软骨分化培养基中，在NPH和组织培养板上培养的BMSCs中所有差异表达基因（DEGs）的GO分析；（B）NPH组DEGs的火山图；（C）在成骨分化培养基中，在HPH和组织培养板上培养的BMSCs中所有DEGs的GO分析；（D）HPH组DEGs的火山图；（E）PI3K-AKT信号通路的富集图；（F）缺氧响应的富集图

4. 体内修复效果：

• 大体观察：术后12周，THMH组实现几乎完全的软骨缺损修复，再生软骨颜色正常，与周围软骨整合良好，表面光滑；ICRS评分显著高于其他组，Goebel评分显著低于其他组。
• Micro-CT：THMH组软骨下骨修复效果良好，骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）显著高于对照组和NPH组，骨小梁分离度（Tb.Sp）显著降低。
• 组织学分析：THMH组术后12周形成类透明软骨，关节表面光滑，组织形态连续，软骨下骨完全重塑，与相邻组织高度匹配；AGG、COL II、Runx2、BMP2等相关蛋白表达显著高于其他组。
• 序列荧光染色：HPH和THMH组新骨形成量多、生长速度快。
• 有限元分析：THMH组应力分散均匀，能有效将载荷传递至软骨下骨，与未填充缺损组相比，应力集中减少86-89%。
• 体内生物相容性：支架植入后无明显炎症反应，对主要器官无损伤。

图5. （A）术后6和12周，不同组修复的大鼠软骨缺损的大体观察、ICRS和Goebel评分（比例尺1mm）；（B）术后6和12周，不同组修复的软骨缺损的番红O-固绿染色（比例尺500μm，放大图100μm）；（C）术后6和12周，SD大鼠股骨髁的横断、矢状和冠状面的3D重建和2D重建的Micro-CT图像（比例尺2mm）；（D）基于Micro-CT图像的骨软骨修复模型中形成的BV/TV、Tb.N、Tb.Th评分和Tb.Sp评分的半定量分析（****p<0.001）

图6. （A）术后6和12周，各组骨软骨缺损处软骨再生标志物AGG和COL II（比例尺100μm）以及骨再生标志物RUNX2和BMP2（比例尺500μm）的免疫组织化学染色；（B）四组中AGG、COL II、RUNX2和BMP2的IHC染色阳性染色区域的比较；（C）术后4和8周，各组软骨下骨缺损部位新形成骨组织的共聚焦荧光图像和荧光强度的定量分析（比例尺：500μm）；（D）治疗12周后，对照组和THMH组在不同弯曲力（0°和90°）加载下，种植体周围骨的冯·米塞斯应力分布；（E）四组中AGG、COL II、RUNX2和BMP2的IHC染色阳性染色区域的比较

三、研究结论

四、论文信息