一、研究背景

骨组织工程（Bone Tissue Engineering, BTE）旨在克服传统骨移植的局限性，如供体部位发病率和免疫排斥反应。传统治疗方法中，自体骨移植（如髂骨）和同种异体移植虽被广泛使用，但存在供体有限、二次手术风险及免疫排斥等问题。因此，开发新型生物活性支架成为研究热点。

近年来，三维（3D）打印技术，尤其是基于挤出的熔融沉积建模（FDM），因其能够精确控制支架结构、几何形状和孔隙率，成为制造个性化骨支架的重要手段。聚己内酯（PCL）作为一种线性脂肪族热塑性聚酯，因其良好的生物相容性、低免疫原性、成本效益和缓慢降解速率，成为3D打印骨支架的理想材料。然而，PCL本身的疏水性限制了细胞黏附和增殖，因此需要表面改性以提高其生物活性。

外泌体（Exosomes）是细胞分泌的纳米级细胞外囊泡，能够携带多种生物活性分子（如蛋白质、核酸、脂质等），在细胞间通讯中发挥重要作用。其在骨再生中的应用逐渐受到关注，尤其是来源于成骨细胞的外泌体（ODExo）在诱导成骨分化方面的潜力尚未被充分挖掘。

二、研究内容

1. 图形摘要（Graphical Abstract）

图形摘要：本研究通过3D打印技术制备PCL支架，经表面等离子体处理与胶原涂层改性后，负载成骨细胞来源外泌体（ODExo）并与hEnMSCs共培养。体外实验证实该复合支架可显著促进干细胞成骨分化；体内大鼠颅骨缺损模型进一步验证其加速骨再生与基质矿化的能力，展示了一种生物仿生、部分无细胞的骨组织工程新策略。

2. 支架制备与表征

采用挤出式3D打印技术制备PCL支架，随后进行等离子体处理以增强表面亲水性，再通过胶原涂层改善细胞黏附性能。支架设计参数包括：孔径约350 μm，丝径约500 μm，孔隙率约53%，压缩模量约58.4 MPa。

图1 3D打印PCL支架形态与胶原涂层表征：(A)不同测试用途的3D打印PCL支架宏观视图，展示几何形状与打印层数；(B)不同放大倍数下的SEM图像，显示支架孔隙与丝径测量结果；(C)FTIR光谱确认胶原成功涂层于PCL表面。

3. 外泌体提取与鉴定

从人成骨细胞样细胞（Saos-2）培养液中提取外泌体，采用超速离心法结合试剂盒纯化。通过动态光散射（DLS）、透射电镜（TEM）、扫描电镜（SEM）和Western blot检测外泌体粒径、形态及表面标志物（CD9、CD63、CD81），确认其身份。

图2 外泌体表征结果：(A)Bradford法测定外泌体蛋白浓度；(B)DLS分析外泌体粒径分布（25–144 nm）；(C)TEM显示典型杯状形态，平均直径约40 nm；(D)SEM确认球形结构，粒径30–150 nm；(E)Western blot检测外泌体标志物CD9、CD63、CD81。

4. 体外成骨分化实验

将人子宫内膜间充质干细胞（hEnMSCs）接种于胶原涂层PCL支架上，分别施加不同浓度（0–250 μg/mL）的ODExo，以不含外泌体的增殖培养基为阴性对照，含成骨诱导液的培养基为阳性对照。通过茜素红S（ARS）染色检测钙沉积，qRT-PCR检测成骨相关基因（ALP、RUNX2、OCN、ON）表达。

图3 外泌体浓度优化与成骨分化：(A)不同外泌体浓度（0–250 μg/mL）下hEnMSCs钙结节形成（ARS染色）；(B)405 nm吸光度定量ARS染色结果，100 μg/mL为最优浓度；(C)ImageJ分析染色面积，支持100 μg/mL为最佳促骨生成浓度。

图4 成骨基因表达分析（qRT-PCR）：(A)RUNX2、(B)Osteonectin、(C)Osteocalcin在第7天表达水平；(D)ALP在第7与14天表达水平。PCL/Col支架+外泌体组显著上调所有成骨基因表达，提示协同促骨生成效应。

5. 体内骨再生评估

建立大鼠颅骨临界尺寸缺损模型（直径1 cm），随机分为6组：空白对照、单独外泌体、单独hEnMSCs、PCL/Col支架、PCL/Col+外泌体、PCL/Col+外泌体+hEnMSCs。术后14、28、42、56天取材，进行组织学（H&E染色）评估骨再生评分（BRS）。

图5 术后28天各组骨再生评分（BRS）代表性H&E图像：可见骨折线（蓝箭）、纤维组织（蓝箭头）、血管（绿箭头）、软骨（黑箭头）及新骨形成（黄箭头）。PCL/Col/Exo与PCL/Col/Exo/hEnMSCs组新骨面积显著高于其他组，BRS分别为19.66±1.52与22.0±2.64，差异有统计学意义（p<0.05）。

图6 术后42天各组BRS代表性图像：控制、Exo、hEnMSCs组仍见明显骨折线及少量新骨；PCL/Col组新骨增多但矿化不完全；PCL/Col/Exo与PCL/Col/Exo/hEnMSCs组可见连续新骨桥接缺损，BRS分别为27.33±1.53与29.0±2.0，显著优于其余各组（p<0.05）。

图7 术后56天各组BRS：空白对照组仅见纤维组织覆盖；单独Exo或hEnMSCs组新骨量有限；PCL/Col组出现板层骨但厚度不足；PCL/Col/Exo组新骨成熟度高；PCL/Col/Exo/hEnMSCs组几乎完成骨缺损闭合，可见骨髓腔（BM）与成熟板层骨，BRS达34.66±2.5，显著高于所有其他组（p<0.05）。

图8 14、28、42、56天各组BRS定量趋势图：空白对照、Exo、hEnMSCs三组BRS增长缓慢；PCL/Col组中等速度提升；PCL/Col/Exo与PCL/Col/Exo/hEnMSCs组呈陡峭上升曲线，其中后者在各时间点均保持最高评分，表明外泌体+干细胞+支架三者协同可显著加速骨缺损修复。

图9 术后8周颅骨缺损Micro-CT三维重建：空白对照组缺损区明显；单独Exo或hEnMSCs组仅边缘少量新骨；PCL/Col组出现散在骨岛；PCL/Col/Exo组新骨覆盖约70%缺损；PCL/Col/Exo/hEnMSCs组缺损基本闭合，骨体积分数（BV/TV）与骨密度（BMD）均显著高于其余各组（p<0.01）。

图10 术后8周缺损中心免疫组化检测：OCN（成骨钙素）与OPN（骨桥蛋白）在PCL/Col/Exo/hEnMSCs组表达最强，阳性面积分别为(32.4±3.1)%与(29.8±2.7)%，显著高于PCL/Col/Exo组(22.1±2.4)%、(20.5±2.2)%及对照组(8.3±1.5)%、(7.6±1.3)%（p<0.001），进一步验证外泌体联合干细胞可加速骨成熟与基质矿化。

三、研究结论

• 支架性能优异：3D打印PCL/Col支架具备可控孔隙率（~53%）、适宜压缩模量（58.4 MPa）及良好亲水性，支持细胞黏附与增殖。
• 外泌体促骨生成：成骨细胞来源外泌体（ODExo）在100 μg/mL浓度下可显著诱导hEnMSCs成骨分化，钙沉积与成骨基因表达均显著提升，效果媲美传统成骨诱导液。
• 协同骨再生：PCL/Col支架联合ODExo与hEnMSCs在大鼠颅骨缺损模型中实现最优骨再生效果，56天后骨再生评分显著高于其他组，证实外泌体可增强干细胞介导的骨修复。
• 临床转化潜力：该细胞/细胞因子联合3D打印支架策略为临界尺寸骨缺损修复提供了新型生物仿生、部分无细胞的骨组织工程方案，具备良好的临床转化前景。

四、论文信息