一、研究背景

应用于外周神经系统的生物电子器件为转化医学提供了广阔前景，可治疗多种疾病，包括慢性偏头痛、中风、癫痫、抑郁症、步态障碍、膀胱过度活动症和高血压等。这些通过外周神经刺激的临床治疗，常是耐药患者化学疗法之外的唯一选择，且技术仍在不断发展。

然而，生物电子界面与外周神经长期可靠性和整合的关键挑战在于异物反应（FBR），这是生物电子器件在体内失效的主要原因。先天免疫细胞最初浸润界面，引发炎症反应，导致富含细胞的异物反应，包括巨噬细胞和多核巨细胞的形成。随着时间推移，成纤维细胞活化导致植入生物电子器件与外周神经界面处沉积富含胶原蛋白的纤维囊。慢性异物反应使这些纤维囊增厚，显著降低记录和刺激过程中的界面电性能，最终影响生物电子器件的使用寿命。

为应对异物反应带来的挑战，已出现多种材料设计策略，包括超软、亲水、润滑、药物缓释、两性离子、生物分子共轭和机械驱动等特性。尽管这些努力旨在减轻纤维化，但由于异物反应的发生在很大程度上与材料无关，以往的尝试均未能成功完全阻止纤维化的发生。因此，开发一种能有效抑制纤维化、实现长期稳定神经调节的生物电子界面具有重要的临床意义。

二、研究内容

2.1 核心研究思路

研究提出，生物电子器件与外周神经界面之间的强粘附性可完全防止纤维囊的形成。生物粘附水凝胶通过与外周神经表面形成共价键，实现生物电子界面的共形接触，从而抑制免疫细胞浸润界面和后续纤维囊的形成。这种粘附性有助于外周神经的电刺激或记录，同时防止界面微动引起的机械驱动型异物反应。

基于此，研究开发了一种粘附性非纤维化生物电子器件（ANB），旨在实现多样化神经上的可靠长期植入，且界面无纤维囊形成。该器件可包裹并粘附于体内不同部位、不同尺寸的外周神经，同时具备柔软、灵活、可拉伸、粘附性和导电性等关键材料特性，以适应生理环境中外周神经的长期稳定通信需求。

2.2 器件设计与制备

ANB采用生物相容性材料设计，用于基于粘附的多种外周神经植入，主要包括三层结构：

• 聚氨酯（PU）绝缘层
• 聚（3,4-乙烯二氧噻吩）-聚苯乙烯磺酸盐（PEDOT:PSS）导电水凝胶
• 聚（乙烯醇）/聚（丙烯酸）（PVA/PAA）基生物粘附水凝胶

由于大鼠外周神经尺寸较小（直径300至1200μm），研究采用多材料三维（3D）打印技术精确图案化绝缘层和导电水凝胶，可在10分钟内快速、方便且精确地制造出分辨率为100μm的生物电子器件。

图1 粘附性非纤维化生物电子器件（ANB）作为非纤维化界面策略的设计和机制。 (A) 生物电子器件治疗疾病的临床应用示意图； (B) 纤维囊形成对神经造成限制的示意图，活跃的异物反应（FBR）导致严重纤维化并阻碍电传递，导致生物电子器件失效； (C) ANB利用生物粘附水凝胶建立非纤维化界面的机制，实现完整的电刺激； (D) 具有非纤维化界面的ANB图像，ANB以牢固且紧密的方式植入腓总神经（CPN）中分离出的腓深神经（DPN）和腓浅神经（SPN），ANB的生物粘附水凝胶与坐骨神经（SN）形成共形接触并防止纤维囊形成； (E) ANB制备和植入的示意图：(1) 通过3D打印图案化绝缘层和导电水凝胶；(2) 在生物电子器件上整合非纤维化粘附水凝胶并完全干燥；(3) 将ANB包裹在DPN周围并在界面处按压5秒以形成酰胺键和氢键； (F) ANB与生物组织接触的界面韧性结果，每个实验独立重复（n=3），统计显著性和P值通过双侧非配对t检验确定（NS表示无显著性差异）。

生物粘附水凝胶膜通过先前建立的方案单独制备，预拉伸以匹配其溶胀率，并在交联后立即附着到3D打印的生物电子器件上，然后干燥。与外周神经接触时，干燥的生物粘附层吸收界面水分，形成氢键（物理交联）和酰胺键（共价交联）。这种基于N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）-胺共价偶联的粘附机制已通过实验验证。

2.3 关键性能表征

2.3.1 机械性能

ANB表现出有利于长期植入的机械性能：

• 低杨氏模量（约0.75 MPa）
• 大最大拉伸率（>1000%）
• 高拉伸强度（约6.8 MPa）

与外周神经直接接触的生物粘附水凝胶层的杨氏模量（约0.1 MPa）与大鼠神经外膜（约0.4±0.1 MPa）相当，确保了与宿主组织的机械相容性。在20%应变下经过10,000次拉伸循环后，器件保持完整，各层之间无分层迹象，其高顺应性和可拉伸性适应了外周神经随身体运动的自然活动，从而提高了其在体内的长期稳定性。

2.3.2 非纤维化界面验证

为验证ANB植入后4周粘附性生物电子界面是否保持非纤维化，研究通过苏木精-伊红（H&E）和马松三色（MT）染色的组织学分析，在Sprague Dawley（SD）大鼠模型中检查了外周神经表面的纤维囊，比较了三组样本：(i) 无植入物的天然组织；(ii) 附着ANB 4周的粘附界面；(iii) 非粘附界面（ANB先在无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中完全溶胀以去除水凝胶的粘附特性，然后缝合在神经上）。

研究考虑了大鼠全身不同尺寸（直径300至1200μm）的外周神经，包括枕神经、迷走神经、腓深神经、坐骨神经、胫神经和腓总神经。组织学分析显示，天然组织的神经外膜周围表面完整，粘附界面未观察到可见的纤维囊形成，与所有考虑的神经的天然组织组相当；而所有非粘附界面在神经外膜外侧均表现出厚且富含细胞的纤维囊，包括脂肪组织坏死和随后的疤痕组织形成。

图2 非纤维化生物电子界面的验证。 (A) ANB在多种外周神经上植入4周，使用了枕神经、迷走神经、腓深神经、坐骨神经、胫神经和腓总神经（CPNs），比例尺为1mm； (B至D) 生物电子器件植入4周前后外周神经的代表性组织学图像，比较三组：天然组织（B）、粘附界面（C）和非粘附界面（D），每条神经均用H&E（左）和MT（右）染色，虚线表示神经的外膜，比例尺为500μm； (E至G) 坐骨神经的放大组织学图像，聚焦于外膜周围的界面，比较天然组织（E）、粘附界面（F）和非粘附界面（G），虚线表示外膜的边界，比例尺为100μm； (H) 多种外周神经外膜厚度的定量分析，箱线图中，中心线表示平均值，须表示数据的第5和第95百分位数，每个实验独立重复（每组n=8），统计显著性和P值通过双侧非配对t检验确定（NS表示无显著性差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。

2.3.3 电性能与稳定性

ANB的电性能表现优异，在1kHz时阻抗约为0.76千欧，导电率良好，电荷存储容量（CSC）约为10.5 mC/cm²，电荷注入容量（CIC）约为290 μC/cm²。与铂电极、纯粘附剂和仅3D打印的生物电子器件（无生物粘附水凝胶）相比，尽管应用生物粘附水凝胶略微降低了整体性能，但ANB仍表现出高质量的刺激电性能，这是因为水凝胶提供了足够的导电性，使电荷能够从电极转移到神经，同时阴极和阳极之间的相对较大间距防止了串扰。

在循环电测试、机械测试和室温PBS浸泡下的分析表明，ANB具有长期稳定性：在100,000次充放电循环中，CSC增加了43%；在100,000次CIC循环中，CIC下降了18%，但仍足以在体内刺激神经；在10,000次拉伸循环（100%拉伸）和室温PBS浸泡12周后，ANB的CSC和CIC保持稳定或有所改善。

图3 ANB与铂电极、纯粘附剂和生物电子器件的电性能和长期稳定性比较。 (A) 不同频率范围内的阻抗（上）和1kHz时的相应阻抗（下）； (B) 电导率图； (C) 电流密度作为施加电位的函数，带有每种材料的抗腐蚀窗口，抗腐蚀窗口的细节在图S14中解释； (D) 根据从最大阳极电位（Ems）到最大阴极电位（Emc）的阴极双相脉冲，电位输入诱导的电流密度； (E) 分别从图(C)和(D)得出的CSC（左轴）和CIC（右轴）的结果图； (F) ANB的CSC与循环伏安法循环（上）和CIC与CIC循环（下）的关系，红色虚线表示第一个循环的初始值，阻抗、电导率、CSC和CIC的值表示平均值和标准差（n=3；独立样本）； (G) 阻抗（左）、CSC（中）和CIC（右）的图，归一化为第一个拉伸循环的初始值，作为100%拉伸下拉伸循环的函数； (H) 阻抗（左）、CSC（中）和CIC（右）的图，归一化为浸泡在PBS溶液中之前的初始值，作为在PBS溶液中浸泡时间的函数，红色虚线表示第一个拉伸循环和浸泡在PBS溶液中之前的初始值，阻抗、CSC和CIC的值表示平均值和标准差（n≥5；独立样本）。

2.4 体内长期血压调控实验

为评估生物电子器件中非纤维化界面的功效和重要性，研究使用ANB或非粘附器件刺激腓深神经（DPN）4周，通过无创尾袖法每周监测自发性高血压大鼠的血压（BP）和心率（HR）。选择血压调控作为主要功能读数，因为它是DPN传导的灵敏整体测量指标，即使是轻微的传导缺陷也会削弱这种全身反应，使血压成为比局部神经电图记录更具转化相关性的指标。

研究通过改变电流脉冲的幅度（0.1至1.0 mA）、宽度（100至1000 μs）和数量（N=1至200个脉冲），确定了最佳刺激参数：0.2 mA、100 μs和N=50个脉冲。使用该参数刺激时，自发性高血压大鼠的血压可降至正常大鼠水平，并在刺激结束后维持40分钟以上，且心率保持在约400次/分钟，未出现传统方法中常见的心率下降副作用。

长期刺激实验表明，ANB在4周的刺激后仍能实现血压调控，达到与正常大鼠相似的水平，各时间点血压下降幅度稳定在33%-37%；而非粘附器件仅在植入后立即能够调控血压，1周后刺激效果显著下降，4周时血压下降幅度仅为2%。

图4 生物电子器件的粘附界面和非粘附界面在DPN刺激下的血压调控和心率变化比较。 (A) 在自发性高血压大鼠（SHR）中使用ANB或非粘附器件进行DPN刺激时，BP和HR测量配置的示意图，比例尺为1mm，W表示周； (B) 比较SHR和正常大鼠在无DPN刺激时的BP和HR图； (C至E) SHR在DPN刺激期间的BP调控特征，三组分别为：电流脉冲幅度变化（0.1至1.0 mA；C）、脉冲宽度变化（100至1000 μs；D）和脉冲数量变化（1至200个脉冲；E），DPN刺激的标准电流脉冲使用0.2 mA的幅度、100 μs的脉冲宽度和N=1个脉冲，绿点表示使用不同电流脉冲的刺激时间，图中显示连续BP（上）和HR（下）； (F) 根据不同电流脉冲的DPN刺激，相应BP（红条；左轴）和HR（蓝条；右轴）的图，以表征BP调控； (G) 4周内长期DPN刺激期间测量的连续BP图，电流脉冲（0.2 mA、100 μs和N=50个脉冲）以0.2 Hz的间隔施加10分钟，由具有粘附界面的ANB（红线；上）和具有非粘附界面的缝合器件（蓝线；下）施加，绿色虚线表示正常大鼠的BP范围（76至85 mmHg），(B)、(F)和(G)中的值表示平均值和标准差，每个实验独立重复（n=3）。

2.5 神经刺激后的免疫荧光分析

为进一步验证粘附性生物电子界面的长期抗纤维化性能，研究对每周刺激一次、植入12周后收集的DPN样本进行了免疫荧光分析，比较了天然组织、ANB和非粘附器件三组样本。结果显示：

• 非粘附界面的神经丝密度比天然组织降低了28%，神经束收缩，表明功能丧失和持续炎症；
• 非粘附植入物的神经内观察到显著的巨噬细胞（CD68）浸润，比天然组织增加了45%；
• 非粘附器件周围的血管生成更强，整个神经外膜和纤维囊的血管密度比天然组织高56%（α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA））；
• 非粘附界面的神经外膜和纤维囊中有大量I型胶原蛋白（Col-I）沉积，导致外膜显著增厚，达到粘附界面厚度的三倍以上；
• 植入ANB的DPN表现出与天然组织相当的神经丝密度，在所有评估指标上都与天然组织非常相似，未观察到神经和粘附界面中的巨噬细胞浸润，神经周围没有可检测到的成纤维细胞活性或纤维化胶原蛋白沉积。

图5 DPN神经刺激后的免疫荧光图像。 (A至C) 比较天然组织（A）、ANB植入12周后的粘附界面（B）和非粘附器件植入12周后的非粘附界面（C）中的神经丝（NF；绿色）、巨噬细胞（CD68；红色）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA；红色）、I型胶原蛋白（Col-I；红色）和细胞核[4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）；蓝色]，NF、CD68、α-SMA、Col-I和DAPI分别代表神经束、巨噬细胞、血管、胶原蛋白和细胞核的标志物，虚线和箭头表示天然组织和非粘附界面的外膜区域以及粘附界面的外膜-ANB区域，在非粘附界面观察到纤维囊，比例尺为200μm； (D至F) 免疫荧光结果的定量分析，比较天然组织（黑色）、粘附界面（红色）和非粘附界面（蓝色）中每1000μm²的NF数量（D）、巨噬细胞数量（E）、血管数量（G）和胶原蛋白总面积（F），每个实验独立重复（每组n≥3），统计显著性和P值通过双侧非配对t检验确定（NS表示无显著性差异，*P<0.05，**P<0.01）。

三、研究结论

1. 研究开发的粘附性非纤维化生物电子器件（ANB）通过生物粘附水凝胶与外周神经形成强共价键连接，成功抑制了免疫细胞浸润和纤维囊形成，在多种外周神经（枕神经、迷走神经、腓深神经、坐骨神经、胫神经和腓总神经）上实现了长达12周的非纤维化界面稳定存在。
2. ANB具有优异的机械性能（低模量、高拉伸性、良好的机械相容性）和电性能（低阻抗、高电荷存储和注入容量），且在长期体内环境中保持稳定，经过10,000次拉伸循环和12周浸泡后仍能维持良好的性能。
3. 在自发性高血压大鼠模型中，ANB通过对腓深神经的长期稳定刺激（长达4周），实现了有效的血压调控，血压下降幅度稳定在33%-37%，且未出现传统方法中常见的心率下降副作用；而非粘附器件的刺激性能在1周后显著下降，4周时几乎完全失效。
4. 免疫荧光分析证实，ANB界面在12周后仍保持与天然神经组织相似的神经丝密度，无明显巨噬细胞浸润、血管异常增生和成纤维细胞活化，而非粘附界面则出现明显的纤维化特征。
5. 该研究提出的基于粘附的策略为解决生物电子器件与外周神经界面的纤维化问题提供了新的有效途径，ANB器件展现出巨大的临床转化潜力，可用于长期、非纤维化的器件整合，为基于生物电子学的疾病治疗、康复和人体增强开辟了新的方向。

四、论文信息