学术分享 I 关于3D打印定向冷冻凝胶纤维复合支架促进骨再生的研究

发布时间：2025-10-23 浏览量：分享到：

sciadv.adk6722.pdf 论文解读（定向冷冻凝胶纤维复合3D打印支架促进骨再生）

一、研究背景

大面积颅骨缺损修复是临床长期面临的难题，目前常用解决方案包括自体血管化骨移植、聚醚醚酮（PEEK）颅骨植入物及钛/钛合金网，但这些方法存在显著局限性：

自体血管化骨移植：虽为临床金标准，但存在移植物与缺损轮廓不匹配导致美观性差、长期吸收引发轮廓不规则需二次修复，且供区疼痛与感染风险高的问题；
合成植入物（PEEK、钛网）：虽避免供区损伤，但并发症率高（暴露、感染需移除）、刚性导致不适，且非降解性与致密结构限制骨整合，易引发植入失败；
现有生物降解材料（如胶原海绵）：虽具备多孔结构利于细胞浸润，但缺乏固有骨诱导性，且降解速度快于新骨形成，易导致类骨质吸收，难以平衡降解与骨长入、机械性能及生物活性不足。

研究团队前期开发的聚己内酯静电纺纳米纤维支架（3D定向拓扑结构）虽实现高效细胞募集与快速骨再生，但3D打印支架普遍存在细胞接种效率低、无法诱导细胞迁移的问题。因此，亟需开发兼具高效细胞募集、血管化促进及骨分化调控能力的新型骨修复支架，以解决大面积颅骨缺损的再生难题。

图1：定向冷冻凝胶纤维（ACFs）复合3D打印支架通过增强细胞募集与功能促进骨再生的机制

A：ACFs复合3D打印支架（PS/ACFs）的制造流程：通过3D打印结合定向冷冻铸造技术将ACFs嵌入3D打印支架，实现细胞募集与组织趋向性（红色箭头示细胞募集，橙色箭头示ACFs在颅骨缺损中的作用）；

B：KP肽（骨形态发生蛋白2模拟肽）与QK肽（血管内皮生长因子模拟肽）功能化的PS/ACFs支架促进大鼠临界尺寸颅骨缺损修复的机制（蓝色箭头示新生胶原纤维方向，绿色箭头示骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨分化）；

注：Gel-MA为甲基丙烯酰化明胶，PS为3D打印支架，BMSC为骨髓间充质干细胞。

二、研究内容

2.1 核心支架设计：定向冷冻凝胶纤维（ACFs）复合3D打印支架

研究提出“结构引导-功能调控”双策略，设计并制备含垂直定向冷冻凝胶纤维（ACFs）且经QK肽（促血管）与KP肽（促成骨）修饰的复合3D打印支架（PS-KP500/ACFs-QK500），制造流程如下：

3D打印支架（PS）制备：采用5wt%甲基丙烯酰化明胶（Gel-MA），通过3D生物打印制备晶格支架，紫外光交联固化后冻干，获得无色透明的晶格结构；
ACFs嵌入：将冻干PS浸泡于0.18wt% Gel-MA与0.02wt%明胶混合液中，转移至-80℃预冷不锈钢板进行定向冷冻与化学交联24小时，冻干后支架孔洞内填充白色垂直定向纤维（对比随机冷冻凝胶纤维（RCFs）无定向冷冻步骤，纤维呈水平分布）；
肽功能化修饰：ACFs表面共轭500μg/ml QK肽（促血管生成），3D打印支架表面共轭500μg/ml KP肽（促成骨分化），最终获得双肽修饰的复合支架。

图2：不含/含ACFs的3D打印支架形貌特征

A：通过3D打印结合冷冻铸造制备ACFs复合3D打印支架的流程示意图（UV为紫外光）；

B：PS与PS/ACFs冻干前后的宏观外观（冻干后PS/ACFs孔洞内填充白色纤维）；

C：PS与PS/ACFs的扫描电镜（SEM）图（俯视图与横截面），可见PS/ACFs孔洞内充满垂直定向纤维，PS无纤维填充；

D：ACFs的伪彩色图（示纤维取向角度分布）；

E：ACFs的取向角度分布（中位角度近90°，呈高度垂直定向）；

F：ACFs的直径分布（1-5μm，均值2.46±0.86μm）；

注：Oct为最佳切割温度化合物。

2.2 支架的理化性能与细胞募集能力

（1）理化性能：

机械性能：湿态PS/ACFs的杨氏模量高于纯PS，最大应变略低于PS，两组最大应力无显著差异，满足骨修复的力学需求；
溶胀与降解：冻干PS与PS/ACFs在37℃磷酸盐缓冲液（PBS）中1小时内达到溶胀平衡；在0.05%胶原酶溶液中3小时内完全降解，降解速度可控；
纤维结构：ACFs呈高度垂直定向（角度近90°），RCFs呈随机分布且垂直于孔洞壁，ACFs直径1-5μm，利于细胞迁移。

（2）细胞募集能力：

图3：ACFs复合3D打印支架的体外细胞接种效率与体内细胞募集能力

A：（i）PS、PS/RCFs、PS/ACFs的体外细胞接种与黏附示意图；（ii）大鼠皮下植入模型评估PS/ACFs的体内细胞募集与组织长入示意图；

B-C：共聚焦显微镜3D图像与SEM图（人脐静脉内皮细胞（HUVECs）接种24小时后）：PS仅表面黏附细胞（深度＜200μm），PS/RCFs细胞迁移至300μm深度，PS/ACFs细胞迁移至600μm深度，且细胞优先附着于纤维区域；

D：CCK-8检测（24小时）：PS/ACFs与PS/RCFs的细胞黏附量为PS的2倍；

E-G：苏木精-伊红（H&E）染色与半定量分析（皮下植入1、2周）：PS/ACFs的Gel-MA晶格间隙内浸润细胞更多，ACFs区域新生组织密度显著高于PS的空白区域，且无纤维囊形成；

H-I：三色染色（2周）：PS组新生细胞外基质（ECM）纤维随机排列，PS/ACFs组呈有序排列（与ACFs方向一致），伪彩色图与角度定量验证PS/ACFs组胶原纤维取向一致性更高；

注：*P<0.001，****P<0.0001，ns为无显著性差异。

关键结论：ACFs通过定向拓扑结构引导细胞深度迁移（达600μm），显著提升细胞接种效率与体内组织长入，且诱导新生ECM纤维定向排列，为骨再生提供结构基础。

2.3 肽功能化支架的促血管与促成骨性能

（1）KP肽修饰支架（PS-KP）的促成骨性能：

图4：KP肽功能化3D打印支架（PS-KP）的促成骨性能

A：PS-KP的制备流程与裸鼠皮下异位成骨模型验证示意图（n=5）；

B：Micro-CT 3D重建图（4周）：PS-KP500组（500μg/ml KP肽）可见明显新生骨，PS、PS-KP250（250μg/ml）、PS-KP750（750μg/ml）组几乎无新生骨；

C：Micro-CT轴位、矢状位与冠状位图像：PS-KP500组新生骨呈与支架一致的晶格形态；

D-G：定量分析（4周）：PS-KP500组的骨体积分数（BV/TV）、骨表面积分数（BS/TS）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）显著高于其他组；

H：三色染色（4周）：PS-KP500组类骨质基质呈团块状分布，其他组仅少量或无类骨质；

I-J：骨桥蛋白（OPN）免疫组化染色与半定量：PS-KP500组OPN表达最高，显著高于PS-KP750组；

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，IOD为积分光密度。

体外实验显示：PS-KP各组的大鼠BMSC（rBMSC）碱性磷酸酶（ALP）活性、ALP/OPN/骨钙素（OCN）基因表达均高于纯PS；体内异位成骨实验证实500μg/ml为KP肽最佳浓度，可显著促进类骨质形成与骨标志物表达。

（2）QK肽修饰支架（PS/ACFs-QK）的促血管性能：

图5：QK肽功能化PS/ACFs（PS/ACFs-QK）的促血管性能

A：PS/ACFs-QK的制备流程与大鼠皮下植入模型评估示意图（n=4）；

B：三色染色（2周）：新生血管数量随QK肽浓度（100-500μg/ml）增加而增多；

C：新生血管数量定量：PS/ACFs-QK500组（500μg/ml）显著高于其他组；

D-E：CD31免疫组化染色与血管面积定量：PS/ACFs-QK300（300μg/ml）与QK500组新生血管面积高于PS与QK100组，且QK500组高于QK300组；

注：*P<0.05，***P<0.001，ns为无显著性差异。

结果表明：500μg/ml为QK肽最佳浓度，可通过模拟血管内皮生长因子（VEGF）功能，显著促进皮下植入区域的新生血管形成，为骨再生提供充足营养。

2.4 双肽复合支架在大鼠临界尺寸颅骨缺损中的骨再生效果

图6：双肽功能化PS/ACFs在大鼠临界尺寸颅骨缺损模型中的骨再生能力（Micro-CT分析）

A：实验支架（PS-KP500/ACFs-QK500）与胶原海绵（阳性对照）植入大鼠8mm直径临界尺寸颅骨缺损的示意图（n=5）；

B：X线原始图像（4、8周）：PS-KP500/ACFs-QK500与胶原海绵组的缺损区域新生骨多于对照组；

C-D：Micro-CT 3D重建图与冠状位图像（4、8周）：PS-KP500/ACFs-QK500组8周时新生骨体积与分布更优；

E-F：定量分析（4、8周）：4周时两组骨体积分数（BV/TV）与表面覆盖率无显著差异；8周时PS-KP500/ACFs-QK500组显著高于胶原海绵组；

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns为无显著性差异。

图7：4周治疗后骨再生的组织学观察

A-B：H&E与三色染色（n=5）：PS-KP500/ACFs-QK500与胶原海绵组缺损区域可见更多新生骨（NB）有机基质，对照组极少；PS-KP500/ACFs-QK500组检测到垂直定向胶原纤维（由ACFs引导），且纤维内形成脱钙有机骨基质；

C-F：缺损边缘与中心区域新生软组织的三色染色与角度分布：对照组与胶原海绵组胶原组织水平排列，PS-KP500/ACFs-QK500组呈垂直排列；

注：NB为新生骨，C为胶原海绵，PS为3D打印支架。

图8：8周治疗后骨再生的组织学观察

A-B：H&E与三色染色（n=5）：8周时PS-KP500/ACFs-QK500组缺损区域新生有机骨基质最多，且支架区域（PS）被新生骨包裹；

C：免疫组化染色（CD31、OCN、OPN、RUNX2）：PS-KP500/ACFs-QK500组的血管标志物（CD31）与成骨标志物（OCN、OPN、RUNX2）表达最高；

D-G：积分光密度定量：PS-KP500/ACFs-QK500组的CD31、OCN、OPN、RUNX2相对表达量显著高于胶原海绵与对照组；

注：*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001，RUNX2为 Runt相关转录因子2（成骨关键转录因子）。

关键发现：

骨再生效率：8周时PS-KP500/ACFs-QK500组的骨体积分数（BV/TV）与表面覆盖率显著高于胶原海绵组，且新生骨呈致密杆状骨小梁形态；
骨稳定性：胶原海绵组8周时出现骨吸收（破骨细胞增多），而PS-KP500/ACFs-QK500组因支架降解缓慢与KP肽持续促成骨，避免骨吸收，实现骨再生持续增强；
机制验证：ACFs引导细胞定向迁移与ECM排列，QK肽促进血管化提供营养，KP肽诱导BMSC成骨分化，三者协同实现高效骨再生。

三、研究结论

结构-功能协同创新：通过定向冷冻凝胶纤维（ACFs）与双肽（QK/KP）修饰的复合设计，解决了传统支架“细胞募集不足、血管化滞后、骨再生缓慢”的问题，实现“早期细胞定向迁移-中期血管化支撑-后期成骨分化”的全程调控；
优异骨再生性能：双肽复合支架（PS-KP500/ACFs-QK500）在大鼠8mm临界尺寸颅骨缺损中，8周时新生骨体积与表面覆盖率显著高于胶原海绵组，且避免骨吸收，骨小梁结构更致密（杆状）；
理化与生物相容性：支架具备适宜的机械性能、可控降解性，体内无纤维囊形成，细胞相容性优异，且可引导ECM定向排列，为骨再生提供仿生微环境；
临床转化潜力：该支架无需细胞或外源性生长因子负载，通过内源性再生机制修复大面积骨缺损，为5G通信、航空航天等领域高功率小型化电子设备提供关键制造技术，为下一代骨再生生物材料设计提供新策略。

四、论文信息

4.1 基础信息

论文标题：Aligned cryogel fibers incorporated 3D printed scaffold effectively facilitates bone regeneration by enhancing cell recruitment and function
发表期刊：Science Advances（《科学·进展》）
发表信息：2024年，10卷，eadk6722，14页
DOI：10.1126/sciadv.adk6722

4.2 材料与方法关键信息

类别	关键参数/步骤
核心材料	甲基丙烯酰化明胶（Gel-MA）、KP肽（BMP-2模拟肽）、QK肽（VEGF模拟肽）、胶原海绵（阳性对照）
支架制备	3D打印参数：25号针头，层高0.2mm，线距1.2mm，打印速度6mm/s；定向冷冻温度-80℃，交联24小时
性能表征	SEM（形貌）、Micro-CT（骨再生定量）、电子万能试验机（机械性能）、CCK-8（细胞活性）
动物模型	大鼠皮下植入模型、裸鼠异位成骨模型、大鼠8mm临界尺寸颅骨缺损模型
组织学分析	H&E染色、三色染色、免疫组化（CD31/OCN/OPN/RUNX2）、TRAP染色（破骨细胞检测）

森工3D打印机功能分析

该研究中涉及的3D打印策略

1、森工可匹配模块:
①紫外固化辅助成型：该模块辅助配备365nm/385m/395m/405m多种波长范围，有效辅助含光引发剂直写材料的辅助固化成型；

②墨水挤出打印：适合低粘度生物材料，如水凝胶、明胶等；

小编对该类研究的拓展设想

1、拓展思路：
①可搭载低温直写喷头/平台模块该模块支持-5℃-室温，能快速提高固化效率，保障材料打印成型效果；

②可升级多通道打印头，实现协同打印不同材料和细胞液滴入进行培养；

③搭载转轴模块为不同直径、不同长度类型的管状支架提供更多实验空间；

④为了提高实验效率，可使用在线混合模块，将生物材料与特定性能材料进行实时比混合，在多喷头协作时间同时满足更多不同打印方式；

2、涉及模块介绍：
①低温直写喷头/平台模块：支持-5℃~室温，喷头料筒满载容量10cc，独立分布式控温，打印材料在料筒及针尖均可实现精确温控；低温平台实现模块化冷井设计，支持对玻片、孔板（6、12、24、48、96孔）直接使用，有效制冷区域尺寸：90mm*90mm*75mm；控温范围：-5℃-室温

②多通道打印头： 2-4通道设计，可装载多材料进行协同/并联打印，如通过设备移液功能，同时进行细胞溶液滴入，提高实验效率；

③转轴模块：旋转轴直径支持：φ1.5 φ2 φ4 φ6 φ8 φ10 φ20 φ25 旋转轴打印长度：φ1.5 φ2 φ4 φ6 φ8 φ10 可打印长度100mm，φ20 φ25 可打印长度95mm；满足更多不同规格直径需求，实现多种个性化组织支架打印；

④在线混合模块：主动混合或者被动混合模式，可实时在线混合，实现指定比例混合材料、在线梯度渐变；

由于小编学识所限，文中内容难免存在疏漏或不足之处。若您发现任何错误或值得商榷的观点，恳请不吝指正，

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