乳酸功能化3D打印PCL/nHA支架通过代谢-表观遗传串扰驱动BMSC成骨研究

1. 研究背景

创伤、感染或肿瘤切除导致的临界尺寸骨缺损是临床治疗的重大难题。目前的金标准治疗方案（如自体移植、异体移植）受限于供体短缺、免疫并发症及感染风险，亟需合成替代材料。

组织工程策略（仿生支架结合干细胞）具有治疗潜力，但仍存在未解决的问题：① 聚己内酯（PCL）支架虽具备可调节降解性、力学耐久性及监管批准资质，但其固有疏水性和低生物活性需与生物活性成分（如天然骨主要无机成分纳米羟基磷灰石nHA）复合；② 现有支架设计无法复刻天然骨组织的动态代谢相互作用；③ 常规常氧体外培养会损害骨髓间充质干细胞（BMSCs）的干性和成骨能力，而缺氧骨髓微环境可通过代谢适应维持这些特性。

乳酸在骨生物学中具有细胞类型依赖性双重作用：对BMSCs可通过组蛋白H3K18乳酸化或嗅觉受体Olfr1440激活发挥促成骨作用，但对牙周膜干细胞则通过MCT1-mTOR介导的自噬抑制抑制成骨；同时乳酸还可调控免疫重编程（如诱导巨噬细胞向M2型极化）。然而，当前研究存在三大空白：① 尚无支架设计利用乳酸的促成骨潜力；② 组蛋白乳酸化以外的机制未被探索；③ 乳酸对成骨关键调控因子（如RUNX2）的影响未知。

2. 研究内容

2.1 支架制备与表征

采用溶剂浇铸结合3D打印技术制备PCL/nHA/SL复合支架，具体参数如下：

• 材料比例：PCL（70% w/w）、nHA（30% w/w），乳酸钠（SL）浓度梯度为0.5%–5% w/w；
• 3D打印参数：喷嘴直径200 μm，纤维直径200±50 μm，孔径330±50 μm，支架尺寸为Φ5 mm×2 mm（圆柱状）；
• 后处理：60℃固化12小时，⁶⁰Co γ射线（25 kGy）灭菌，无菌PBS冲洗2次；
• 性能检测：检测1、3、7、14、21、28天的pH值、重量损失、Ca²⁺释放量；37℃模拟体液（SBF）中摇瓶培养28天评估降解率，采用电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES）检测离子浓度。

2.2 BMSCs分离与培养

使用人BMSCs（ATCC® PCS-500-012™），在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养（37℃、5% CO₂），选用第3代细胞进行实验；支架接种密度为4×10⁴个细胞/支架，分别采用基础培养基或成骨诱导培养基（含0.1 mM地塞米松、8 mM β-甘油磷酸钠、50 μg/mL抗坏血酸）培养，每3天换液。

2.3 生物相容性与细胞活力检测

• 细胞活力：采用LIVE/DEAD®试剂盒（2 μM钙黄绿素-AM、4 μM碘化丙啶）染色，Cytation5细胞成像仪观察；
• 细胞增殖：CCK-8法检测1、3、5、7天的吸光度（450 nm）；
• 细胞骨架分析：4%多聚甲醛（PFA）固定，0.1% Triton X-100透化，Alexa Fluor™ 594-鬼笔环肽（F-actin，红色）和DAPI（细胞核，蓝色）染色，Zeiss LSM 880共聚焦显微镜（63×油镜）观察。

2.4 成骨分化评估

• 碱性磷酸酶（ALP）活性：采用p-硝基苯磷酸（pNPP）底物检测7、14天活性，结果归一化为总蛋白浓度（BCA法）；
• 钙沉积：20 μM二甲酚橙（XO）和茜素红S（ARS）染色，ImageJ定量荧光强度（德克萨斯红滤光片）和矿化结节面积；
• 成骨标志物：Western blot检测RUNX2、COL1A1、OCN、OPN（蛋白上样量20 μg/泳道，抗体稀释比1:1000）；
• 乳酸浓度：采用乳酸检测试剂盒（Biovision, K607-100）检测1、7、14、21天培养基中乳酸水平。

2.5 赖氨酸乳酸化蛋白质组学

BMSCs在PCL/nHA/SL或PCL/nHA支架上培养14天后，提取蛋白并胰酶消化，采用抗K-Lac抗体偶联磁珠富集乳酸化肽段，通过4D无标记LC-MS/MS（timsTOF Pro质谱仪，Bruker）分析；使用MaxQuant（v1.6.15.0）匹配UniProt人类数据库（2022），筛选差异乳酸化位点（FC>1.5，P<0.05），并进行GO/KEGG富集分析（Fisher精确检验，P<0.05）；手动验证STAT1-K193乳酸化（Mascot评分>200，定位概率>99%）。

2.6 基因修饰与实验组设计

采用慢病毒转染（MOI=20，2 μg/mL聚凝胺孵育72小时）进行基因修饰，设计两组关键实验：

实验1：STAT1乳酸化对STAT1-Runx2相互作用的影响（Table 1）

转染后48小时进行机制检测：免疫荧光检测STAT1/Runx2共定位；Co-IP（STAT1抗体 pull-down）检测乳酸化和Runx2结合；ChIP-qPCR检测Runx2与骨钙素启动子的结合；Western blot检测Runx2和OCN表达（GAPDH归一化）。

实验2：STAT1-K193R对乳酸诱导成骨的影响（Table 2）

成骨诱导培养基培养14天后，检测ALP活性、ARS矿化及Western blot（Runx2、COL1A1、OCN、OPN），全程定量乳酸水平。

2.7 STAT1乳酸化功能研究

• Co-IP：细胞裂解液与抗STAT1抗体（或对照IgG）4℃孵育过夜，Protein A/G琼脂糖珠 pull-down，免疫印迹检测K-乳酸化（1:300）和STAT1（1:500）；
• 亚细胞定位：免疫荧光（抗STAT1抗体1:200，Alexa Fluor® 488/555二抗）检测STAT1分布；
• 突变体转染：Lipofectamine 3000将HA标记的STAT1突变体（K193R、K584R）转染293T细胞；
• STAT1-RUNX2相互作用：ChIP（抗RUNX2抗体）结合骨钙素启动子特异性引物检测。

2.8 体内骨再生实验

对SD大鼠（n=6/组）构建5 mm直径临界尺寸颅骨缺损模型，实验组植入支架，对照组不处理；12周后取材，4% PFA固定，采用：① 显微CT（Skyscan 1176）扫描，CTAn软件定量新骨形成（BV/TV、Tb.N、Tb.Th）；② 组织学染色（HE、Masson三色染色）；③ 免疫组化（OCN、RUNX2）。

2.9 统计分析

数据以均值±标准差（n=3）表示，采用Student t检验或单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey事后检验（GraphPad Prism 9.0），P<0.05为差异有统计学意义。

Fig. 1. PCL/nHA/SL支架中乳酸最佳浓度确定。（A）乳酸释放动力学：PCL/nHA/SL支架的乳酸持续释放与PCL/nHA支架的基线水平对比；（B）CCK-8检测：0.5%–1%（w/w）乳酸维持细胞活力，5%乳酸显著抑制增殖；（C）Western blot分析7天培养的早期成骨标志物（Runx2、COL1A1）；（D）Western blot分析14天培养的晚期成骨标志物（OCN、OPN）。（数据归一化至β-actin；结果表示为均值±标准差；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001）

Fig. 2. 聚己内酯/纳米羟基磷灰石（PCL/nHA）和聚己内酯/纳米羟基磷灰石/乳酸钠（PCL/nHA/SL）复合支架的生物相容性评估。（A）模拟体液（SBF）中的pH值变化；（B）支架在SBF中的重量损失；（C）支架随时间释放的Ca²⁺浓度；（D）BMSCs在支架上培养1、3、5、7天的活/死染色（比例尺：300 μm；活细胞：绿色；死细胞：红色）；（E）活细胞密度定量分析：两组增殖动力学相当；（F）CCK-8检测：细胞增殖呈时间依赖性，组间无差异（p>0.05）；（G、H）鬼笔环肽/DAPI染色及荧光强度定量：细胞骨架广泛铺展（比例尺：300 μm；F-肌动蛋白：红色；细胞核：蓝色）。（结果表示为均值±标准差；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001）

Fig. 3. 支架的成骨分化潜力。（A）XO染色（14、21天）显示钙沉积（红色荧光，比例尺：300 μm）；（B）矿化面积（%）定量；（C）ALP活性时间曲线：PCL/nHA/SL支架促进早期分化，联合成骨诱导处理（PCL/nHA/SL+OD）活性达峰值；（D）乳酸释放动力学：PCL/nHA/SL支架的乳酸持续释放与PCL/nHA支架的基线水平对比；（E）21天培养过程中成骨标志物（Runx2、COL1A1、OCN、OPN）的Western blot分析。（数据归一化至β-actin；结果表示为均值±标准差；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001）

Fig. 4. 赖氨酸乳酸化蛋白质组学。（A）乳酸化位点火山图（PCL/nHA vs PCL/nHA/SL）：红色/蓝色分别表示上调/下调位点；（B）乳酸化蛋白的GO/KEGG富集分析（如骨化调控、成骨细胞分化、JAK-STAT通路）；（C）MS/MS谱图验证STAT1-K193乳酸化；（D）乳酸化位点序列基序分析：热图显示乳酸化位点周围的氨基酸偏好性。

Fig. 5. STAT1乳酸化功能表征。（A）免疫印迹检测全局K-Lac水平；（B）Co-IP（抗乳酸赖氨酸抗体）验证STAT1乳酸化；（C）STAT1亚细胞定位：PCL/nHA/SL组（7–14天）STAT1胞质聚集，PCL/nHA对照组呈核-质分布（比例尺：20 μm；STAT1：绿色；DAPI：蓝色）；（D）环己酰亚胺追踪实验评估STAT1蛋白稳定性；（E）免疫荧光显示乳酸诱导STAT1胞质转运。（数据归一化至β-actin；结果表示为均值±标准差；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001）

Fig. 6. K193乳酸化调控STAT1亚细胞转运。（A）Co-IP验证STAT1突变体的乳酸化水平差异；（B）HA标记STAT1变体的亚细胞定位：PCL/nHA/SL培养中，WT和K584R定位于胞质，K193R滞留于核内（比例尺：20 μm；STAT1：绿色；DAPI：蓝色）。（数据归一化至β-actin；结果表示为均值±标准差；*p<0.05）

Fig. 7. 乳酸化依赖性STAT1-Runx2相互作用。（A）Runx2核转运共聚焦成像：STAT1-KD细胞中Runx2核转运增强，STAT1-OE抑制该过程，支架共培养可恢复（比例尺：20 μm；Runx2：红色；STAT1：绿色；DAPI：蓝色）；（B）Co-IP分析STAT1-Runx2结合；（C）STAT1-Runx2轴调控OCN表达；（D）ChIP-qPCR显示乳酸化依赖性STAT1在Runx2启动子的染色质占据。（数据归一化至β-actin；结果表示为均值±标准差；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001）

Fig. 8. STAT1乳酸化机制的基因验证。（A）ARS染色（14天）显示矿化差异；（B）14天成骨标志物和STAT1的Western blot；（C）STAT1-KD+K193R突变体组的ALP活性降低。（数据归一化至β-actin；结果表示为均值±标准差；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001）

Fig. 9. 体内骨再生性能。（A）12周组织学分析：HE染色、Masson三色染色及OCN/RUNX2免疫组化（红色比例尺：500 μm；绿色比例尺：100 μm；N：新骨；F：纤维组织；S：残留支架）；（B）缺损部位3D显微CT重建（红色比例尺：500 μm）；（C）显微CT定量参数：骨体积分数（BV/TV，%）、骨小梁数量（Tb.N，mm⁻¹）、骨小梁厚度（Tb.Th，mm）。（结果表示为均值±标准差；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001）

3. 研究结论

1. 支架优化与生物相容性：1% SL为最佳浓度，可维持BMSCs活力（>95%）并显著促进成骨分化；PCL/nHA/SL支架在28天降解过程中维持pH 5.8–6.6（轻度酸性），持续释放低浓度Ca²⁺，无明显细胞毒性。
2. 成骨分化增强：基础条件下，PCL/nHA/SL支架14天钙沉积是PCL/nHA的2.1倍；成骨诱导条件下，21天钙沉积是PCL/nHA的2.4倍；ALP活性从7天起提升2.4–2.7倍，成骨标志物（Runx2、COL1A1、OCN、OPN）呈阶段特异性上调（早期Runx2/COL1A1先升，晚期OCN/OPN后升）。
3. 乳酸化调控机制：蛋白质组学鉴定出190个蛋白的376个差异乳酸化位点，其中STAT1-K193乳酸化是关键：① 乳酸化诱导STAT1胞质聚集，延长其半衰期（从3.07 h至4.94 h）；② 破坏STAT1与RUNX2的结合，解除对RUNX2的抑制，激活成骨转录程序；③ K193是唯一关键乳酸化位点，K193R突变体可完全阻断乳酸诱导的成骨效应。
4. 体内骨再生效果：PCL/nHA/SL支架12周可实现临界尺寸颅骨缺损的近完全修复，形成致密有序的骨小梁网络；显微CT显示BV/TV、Tb.N、Tb.Th显著高于对照组（P<0.01 vs 空白对照，P<0.05 vs PCL/nHA），免疫组化证实OCN/RUNX2持续高表达。
5. 研究意义：提出“3D打印结构+乳酸代谢重编程”的新型生物材料策略，首次揭示非组蛋白（STAT1）乳酸化介导的代谢-表观遗传串扰机制，为骨组织工程提供可转化的修复平台。

4. 论文信息

• 论文标题：乳酸功能化3D打印PCL/nHA支架通过代谢-表观遗传串扰驱动BMSC成骨研究
• 作者信息：曾敏^a,b，刘浩^a,b，卢伟^a,b，陈灿^a,b，林章远^a,b，赵瑞波^a,b,*；^a中南大学湘雅医院骨科，中国长沙；^b中南大学湘雅医院国家老年疾病临床医学研究中心，中国长沙；*通讯作者：赵瑞波，邮箱：370781162@qq.com
• 期刊信息：Materials Today Bio，Volume 33, 2025, Article 102101；期刊主页：www.journals.elsevier.com/materials-today-bio
• DOI：https://doi.org/10.1016/j.mtbio.2025.102101