二、研究内容
2.1 材料与方法
（1）实验材料
- 羟基磷灰石（HAp）：粉末状，平均粒径＜1 μm，分子量502.31 g/mol（Acros Organics，美国）；
- 海藻酸钠（SA）：低黏度粉末，平均分子量427 kDa（Sigma–Aldrich，意大利米兰）；
- 胶原肽：鱼源（Coll₆）与牛源（Collᵦ），粉末状，平均分子量2 kDa（Lapi Gelatine S.p.A.，意大利）；
- 细胞与试剂：人真皮成纤维细胞（HDFs）、DMEM培养基、青霉素/链霉素、BCA蛋白定量试剂盒等（Merck、GIBCO等品牌）。
（2）生物墨水制备
制备两种生物墨水（HAp/SA/Coll₆、HAp/SA/Collᵦ），三者质量比为5.5:10:10：① 将10%（w/v）胶原肽（Coll₆或Collᵦ）溶于蒸馏水，60℃搅拌30 min；② 加入10%（w/v）HAp，充分分散；③ 加入5.5%（w/v）SA，60℃持续搅拌1 h，室温温和搅拌过夜至均一。
（3）表征与测试方法
- FTIR分析：采用Agilent Cary 630 FTIR光谱仪（ATR模式），4000–500 cm⁻¹波数范围，分辨率4 cm⁻¹，分析胶原肽化学结构；
- 流变学表征：使用MCR 92流变仪（25 mm平行板，间隙50 μm），测试频率0.05–100 Hz下的黏度（η）、储能模量（G'）、损耗模量（G''）与剪切应力（τ）；
- 3D打印：采用DIW墨水直写生物3D打印机，27 G锥形喷嘴，气动挤出；打印参数见表4，打印后用1%（w/v）CaCl₂溶液交联10 min；
- 可打印性评估：① 细丝融合测试：打印单层平行细丝（间距1.4–1.8 mm），ImageJ测量细丝融合长度（fₛ）、厚度（fₜ）、间距（f_d）；② 宏观多孔结构（20×20×0.6 mm³方格）：计算可打印性（Pᵣ）、扩散率（Dᵣ）、收缩率（S）；
- 凝胶分数分析：打印10×10×1 mm³样品，交联后干燥称重（W₀），蒸馏水浸泡24 h后再次干燥称重（W_f），凝胶分数=（W_f/W₀）×100%；BCA法定量释放的胶原肽；
- 溶胀测试：样品交联后称重（Wᵢ），37℃ PBS中浸泡48 h，不同时间点称重（Wₛ），溶胀率=（Wₛ–Wᵢ）/Wᵢ×100%；
- 细胞相容性评估：间接细胞毒性测试（刃天青代谢法），检测HDFs在生物墨水浸提液中的代谢活性。
2.2 结果与分析
（1）胶原肽FTIR分析
图1 （A）Coll₆和Collᵦ粉末样品的FTIR光谱；（B）经缩放后的FTIR光谱及相关吸收峰标识（注：缩放方法为扣除背景后，以1629 cm⁻¹共有的最强峰强度归一化）
两种胶原肽的FTIR光谱无显著化学结构差异，主要吸收峰位置一致：3250 cm⁻¹、1500–1600 cm⁻¹、500 cm⁻¹，符合胶原蛋白特征吸收区间（700–1700 cm⁻¹、2800–3500 cm⁻¹）。通过二阶导数分析定位的吸收峰，可归属为多肽特征化学键振动（见表1），仅部分峰的相对强度存在微小差异（归因于氨基酸组成差异）。
| 波数 [cm⁻¹] | 化学键振动模式（拉伸ν/面内弯曲δ） |
|---|---|
| 861 | ν(C-O)、ν(C-H)、δ(C-O-H)、δ(C-O-C) |
| 921 | ν(C-O)、ν(C-H)、δ(C-O-H)、δ(C-O-C) |
| 965 | ν(C-O)、ν(C-H)、δ(C-O-H)、δ(C-O-C) |
| 1021 | ν(C-O) |
| 1077 | ν(C-O) |
| 1200 | δ(N-H)、ν(C-N) |
| 1234 | δ(N-H)、ν(C-N) |
| 1319 | δ(CH₂)、δ(N-H)、ν(C-N) |
| 1387 | δ(CH₂)、δ(CH₃) |
| 1442 | δ(CH₂)、δ(CH₃) |
| 1517 | δ(N-H)、ν(C-N) |
| 1629 | ν(C=O) |
| 2870 | ν(C-H)、ν(CH₃) |
| 2933 | ν(C-H)、ν(CH₂)、ν(O-H) |
| 3056 | ν(C-H)、ν(N-H)、ν(O-H) |
| 3270 | ν(O-H) |
| 3322 | ν(N-H) |
表1 胶原肽FTIR吸收峰位置及对应化学键振动模式
（2）生物墨水流变学表征
图2 溶液在0.4–100 Hz频率范围内的流变学表征：（A）黏度与剪切应力；（B）储能模量（G'）与损耗模量（G''）
① 频率＜0.3 Hz时，两种墨水测试数据不稳定（黏度随机骤降），故仅分析0.4–100 Hz数据；② 两者均为非牛顿剪切变稀流体：频率升高时，黏度显著降低，剪切应力明显升高；其中Coll₆基墨水黏度略高于Collᵦ基墨水；③ 黏弹性：两者均表现为"类固体行为"（全频率范围G'＞G''），G'随频率适度升高，G''基本不随频率变化；该特性保障挤出时细丝结构完整性。
（3）可打印性评估
图3 （A）HAp/SA/Coll₆墨水、（B）HAp/SA/Collᵦ墨水的细丝融合测试结果；（C）两种墨水的fₛ/fₜ与f_d关系图（***p≤0.001，**p≤0.01，*p≤0.05）
细丝融合测试：相邻细丝存在轻微融合趋势，且随间距（f_d）减小更显著；f_d=1.4 mm（最小间距）时，HAp/SA/Coll₆墨水的fₛ显著低于HAp/SA/Collᵦ墨水（p≤0.001），表明其打印分辨率更优，可构建更精细结构。
图4 （A）HAp/SA/Coll基墨水打印20×20×0.6 mm³方格的过程；（B）两种墨水打印方格在交联前后的可打印性评估
| 墨水类型 | 可打印性（Pᵣ） | 扩散率（Dᵣ） | 收缩率（S, %） |
|---|---|---|---|
| HAp/SA/Coll₆ | 0.82±0.01 | 39.51±3.41 | 13.62±1.41 |
| HAp/SA/Collᵦ | 0.85±0.01 | 43.72±3.39 | 12.88±0.85 |
表2 两种生物墨水的可打印性评估参数（均值±标准差；Pᵣ：可打印性，Dᵣ：扩散率，S：收缩率）
方格结构打印：① 两种墨水Pᵣ均接近1.0（良好可打印性），HAp/SA/Collᵦ墨水的Pᵣ（0.85±0.01）显著高于HAp/SA/Coll₆墨水（0.82±0.01，p≤0.001），表明其孔隙可打印性更优；Pᵣ＜1.0均因墨水轻微欠凝胶化，导致孔隙呈圆形而非方形；② 扩散率（Dᵣ）：HAp/SA/Coll₆墨水的Dᵣ（39.51±3.41）显著低于HAp/SA/Collᵦ墨水（43.72±3.39，p≤0.01），说明其细丝扩散更少，孔隙闭合效应更弱，几何保形性更优；③ 收缩率（S）：两种墨水收缩率均较低，HAp/SA/Collᵦ墨水的S（12.88±0.85%）略低于HAp/SA/Coll₆墨水（13.62±1.41%），交联后形状保留更优。
