一、研究背景

骨缺损由创伤、肿瘤或感染等因素引发，在临床治疗中是一项重大挑战。这类缺损常导致骨折延迟愈合、肌肉骨骼功能障碍等严重并发症，极大地影响患者的生活质量。当前主要的治疗策略包括自体移植、异体移植和人工支架植入，但这些方法均存在明显局限性。自体和异体移植物面临供体短缺、供区病损以及免疫排斥等问题，而骨缺损复杂且不规则的几何形状，进一步增加了这些方法的应用难度。

骨组织工程（BTE）的发展为加速骨再生带来了新的希望，3D打印支架凭借其能够精确定制内部结构以匹配缺损部位的优势，成为极具潜力的解决方案。与冷冻干燥和溶剂浇铸等传统支架制造方法产生的随机内部结构不同，3D打印的定制化设计显著增强了支架支持细胞生长和促进骨愈合的能力。

血管生成在骨再生过程中起着关键作用，它能促进成骨细胞活性，支持血管系统和矿化基质的同步发育。若缺乏有效的血管生成，血管浸润速度过慢，会导致细胞存活和骨组织形成所需的氧气和营养供应不足。因此，整合支架、细胞和信号分子的策略，对于同时增强成骨和血管生成、提高骨再生效果至关重要。

近年来，将多功能纳米材料引入支架以调节细胞行为并提供外部场响应性受到广泛关注。氧化铁纳米颗粒（IONPs）因其超顺磁性、良好的生物相容性、易于合成、纳米尺寸和低毒性等特性，在骨组织工程中展现出巨大潜力。此外，聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）作为一种经FDA批准的可生物降解聚合物，具有降解速率可调、生物相容性好以及可通过3D打印定制微观结构等优点。

尽管基于IONPs的骨支架在增强成骨和血管生成方面的潜力已得到认可，但相关潜在机制尚未完全明确。基于此，本研究旨在制备负载IONPs的3D打印PLGA支架，并探究其在静态磁场（SMF）下体内外促进成骨和血管生成的能力及相关分子机制。

二、研究内容

（一）支架的制备与表征

1. 材料准备：从相关供应商处获取Fe₂O₃磁性纳米颗粒、PLGA、1,4-二氧六环等材料。将PLGA溶解在1,4-二氧六环中，浓度为15g/100mL，搅拌过夜后，分别加入0%、10%、20%和30%含量的Fe₂O₃磁性纳米颗粒，超声振荡使纳米颗粒均匀分散，得到不同比例的复合溶液。

2. 3D打印制备支架：采用低温挤出式3D打印技术，在-30℃下将复合溶液逐层喷射，喷嘴直径200μm，温度12℃，扫描速率22mm/s，喷丝填充速率0.3mm/s，支撑层厚度400μm，最终制成立方多孔支架。之后将支架在冷冻干燥机中冻干48h，再在37℃真空烘箱中干燥7天，以完全去除1,4-二氧六环，所得支架分别命名为PLGA、P10F、P20F和P30F。

3. 支架表征：

• 利用扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）观察支架表面形态、孔径及Fe₂O₃颗粒尺寸和分布；
• 通过能量色散光谱（EDS）分析支架元素组成；
• 采用乙醇置换法测定支架孔隙率；
• 运用纳米颗粒跟踪分析（NTA）检测纳米颗粒尺寸和浓度；
• 使用接触角测量仪测定水接触角（WCA）以评估表面亲水性；
• 借助万能测试系统进行压缩力学性能测试；
• 通过在PBS缓冲液（pH7.4）中浸泡支架，定期检测降解液pH值和Fe³⁺浓度，评估支架降解性能；
• 检测支架的饱和磁化强度，分析其超顺磁性。

图1. PLGA/Fe₂O₃复合支架的制备与表征。A：支架制备流程；B：Fe₂O₃颗粒TEM图像；C：Fe₂O₃颗粒尺寸分布；D：不同支架的宏观照片和SEM图像；E：不同支架的元素分布图；F：水接触角测试结果；G：孔隙率测试结果；H：垂直方向压缩力学性能；I：水平方向压缩力学性能；J：饱和磁化强度；K：降解过程中pH值变化；L：降解过程中Fe³⁺释放量变化

（二）体外实验

1. 细胞培养：获取人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs），分别在相应的培养基中培养，hBMSCs使用添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的MSC培养基，HUVECs使用添加10%FBS和1%青霉素-链霉素的高糖杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM），在37℃、5%CO₂环境下培养，选用3-5代的hBMSCs和达到80-90%汇合度的HUVECs进行后续实验。

2. 细胞相容性检测：

• CCK-8实验：将灭菌后的不同支架与hBMSCs和HUVECs共培养，在1、3、5、7天分别采用CCK-8法检测细胞活力，通过酶标仪在450nm处测量吸光度。
• 活/死染色实验：共培养48h后，用钙黄绿素-AM和碘化丙啶染色液对细胞进行染色，荧光显微镜观察并进行3D重建，分析细胞存活和分布情况。

图2. PLGA/Fe₂O₃支架在有无磁场刺激下的体外细胞相容性。A：不同时间点HUVECs和BMSCs在不同支架上的细胞活力（CCK-8法）；B：BMSCs和HUVECs在PLGA和P20F支架上培养3天后的活/死染色图像及定量分析（绿色：活细胞；红色：死细胞；比例尺：100μm）

3. 成骨分化相关实验：

• 将hBMSCs接种到培养板上，贴壁过夜后，将不同组支架置于细胞层上，在静态磁场下用成骨诱导培养基培养，每3天更换一次培养基。
• 第14天进行茜素红S（ARS）染色，评估钙沉积情况；
• 第7天和第14天采用pNPP-based ALP检测试剂盒定量检测碱性磷酸酶（ALP）活性；
• 通过Western blot分析成骨相关转录因子Runx2的表达。

4. 血管生成相关实验：

• 划痕愈合实验：将HUVECs接种到24孔板，达到80-90%汇合度后，用200μL移液管尖端在单层细胞上制造划痕，将不同组支架置于划痕区域，孵育24h后，相差显微镜拍摄伤口愈合情况。
• Transwell迁移实验：Transwell小室预先用基质胶包被并固化，上室接种HUVECs，下室加入含10%FBS的培养基作为趋化因子，同时将支架置于下室底部，在静态磁场下孵育48h后，去除上室未迁移细胞，固定、染色并计数迁移细胞数。
• 管形成实验：将基质胶加入24孔板，孵育使其聚合，HUVECs重悬于含不同支架48h提取物的完全培养基中，接种到基质胶包被的孔中，孵育6h后，倒置相差显微镜观察管样结构并测量总管长。
• Western blot分析血管生成相关蛋白VEGFR2和HIF-1α的表达。

图3. 磁场刺激下PLGA/Fe₂O₃支架的体外成骨和血管生成潜力评估。A：HUVECs在不同支架上的划痕愈合实验图像（0h和24h）；B：HUVECs在支架提取物作用下的管形成实验图像（40×和100×放大倍数）；C：HUVECs的Transwell迁移实验结果及定量分析；D：BMSCs在不同支架上培养14天的茜素红S染色图像及不同时间点ALP活性定量分析；E：HUVECs中HIF-1α和VEGFR2表达的Western blot分析及定量；F：BMSCs中RUNX2表达的Western blot分析及定量

5. Fe³⁺和IONPs作用探究：制备与6周（3mg/L Fe³⁺）和8周（16mg/L Fe³⁺）累积Fe³⁺释放量相当的FeCl₃溶液，以及相同摩尔铁含量的IONPs悬浮液，分别与hBMSCs和HUVECs共培养，检测细胞活力、ALP活性、矿化情况及细胞迁移能力，以区分Fe³⁺和IONPs的作用。

（三）体内实验

1. 动物模型建立：选取新西兰兔，随机分为对照组、PLGA组和P20F组。通过腹腔注射戊巴比妥钠和异氟醚麻醉兔子，在双侧股骨远端髁处制造直径10mm、深度1.5cm的骨缺损隧道，将相应支架植入隧道。术后腹腔注射青霉素预防感染，在兔子笼底部均匀布置钕铁硼（NdFeB）永磁体，以产生覆盖整个活动区域的均匀静态磁场，使兔子在自由活动时持续接受磁场刺激。

2. 样本采集与处理：术后6周和12周，用异氟醚麻醉兔子，分离股骨髁，一部分用于micro-CT分析，另一部分固定、脱钙后用于组织学分析。

3. micro-CT分析：

• 骨再生评估：将样本固定后，使用高分辨率micro-CT系统扫描，重建横截面图像，定义感兴趣区域（ROI），计算骨体积分数（BV/TV）、小梁厚度（Tb.Th）、小梁数量（Tb.N）、小梁分离度（Tb.Sp）和骨矿物质密度（BMD）等骨形态计量学参数。
• 血管生成评估：兔子安乐死后，通过腹主动脉灌注肝素化生理盐水和10%中性缓冲福尔马林，然后注射不透射线的硅橡胶铸造剂Microfil，固化后分离样本，脱钙后进行micro-CT扫描和血管分割，计算血管体积占ROI总体积的比例。

图4. 静态磁场刺激下兔股骨缺损模型的体内骨再生和血管生成评估。A：手术设计示意图及支架植入过程；B：术后6周和12周股骨缺损区域骨和血管的micro-CT三维重建图像；C-F：不同时间点骨体积相关参数（BV/TV、Tb.N、Tb.Sp、BMD）的定量分析；G：不同时间点血管体积的定量分析

4. 组织学分析：将收集的标本固定、脱钙、包埋在石蜡中，切成5μm厚的切片，进行Goldner三色染色和免疫组织化学染色，检测OCN（成骨细胞活性和骨形成标志物）、CD31（内皮细胞标志物）和VEGFA（血管生成活性标志物）的表达，由独立技术人员对切片进行编码，两名独立观察者进行评分和定量分析。

图5. 植入后6周和12周体内血管生成和成骨的组织学和免疫组织化学评估。A：空白组、PLGA组和P20F组股骨缺损部位的组织学和免疫组织化学染色图像（CD31、OCN、VEGFA染色及Goldner三色染色）；B-E：6周和12周时CD31、OCN、Goldner三色染色及VEGFA免疫组织化学染色的平均光密度（MOD）定量分析

（四）蛋白质组学与生物信息学分析

1. 蛋白质提取与质谱分析：将hBMSCs和HUVECs与不同组支架共培养48h后，提取总蛋白，采用过滤器辅助样品制备（FASP）方案进行蛋白质纯化和酶解，通过Q Exactive质谱仪结合Easy-nLC 1000系统进行质谱分析。

2. 数据分析：使用MaxQuant软件处理原始数据，采用目标-诱饵搜索策略进行肽段和蛋白质鉴定，控制假发现率（FDR）<1%。通过双侧t检验计算p值，筛选出p<0.05且倍数变化（FC）>1.5或<1/1.5的差异表达蛋白（DEPs）。对DEPs进行基因本体论（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析，可视化前20个显著富集的GO术语和KEGG通路。

（五）分子机制验证

1. Western blot验证：提取不同处理组细胞的总蛋白和核蛋白，采用BCA蛋白测定试剂盒检测蛋白浓度，通过SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，转移到PVDF膜上，封闭后加入一抗孵育过夜，再加入HRP标记的二抗孵育，使用增强化学发光检测系统可视化蛋白条带，并用ImageJ软件分析，以GAPDH和纽蛋白作为内参。

2. 免疫共沉淀（Co-IP）实验：hBMSCs与PLGA或P20F支架共培养24h后，收集总蛋白裂解物，与抗CRYAB抗体孵育过夜，使用Thermo Scientific™ Pierce™ Magnetic IP/Co-IP试剂盒进行免疫沉淀，免疫沉淀复合物经SDS-PAGE和Western blot分析，检测CRYAB与β-连环蛋白的相互作用。

图6. 静态磁场刺激下PLGA/20%Fe₂O₃支架激活的血管生成和成骨通路的蛋白质组学分析及机制验证。A：蛋白质组学分析流程；B：HUVECs中不同组的主成分分析（PCA）；C：HUVECs中差异表达基因的韦恩图；D：HUVECs中P20F与PLGA组的火山图；E：GO术语分布；F：HUVECs中KEGG通路富集分析及基因与GO术语关联；G：BMSCs中不同组的PCA；H：BMSCs中差异表达基因的韦恩图；I：BMSCs中P20F与PLGA组的火山图；J：BMSCs中GO富集分析；K：BMSCs中GO术语-蛋白质相互作用图；L：BMSCs中PI3K、AKT、CRYAB、β-连环蛋白表达的Western blot分析及Co-IP实验结果；M：BMSCs和HUVECs中相关蛋白表达的定量分析

图7. 支架制备及静态磁场刺激下PLGA/Fe₂O₃支架诱导成骨和血管生成的机制示意图。A：3D打印磁性支架的制备过程；B：在静态磁场刺激下，植入的PLGA/Fe₂O₃支架在骨缺损区域同时增强血管生成和成骨的分子机制

（六）统计学分析

所有实验每组至少重复三次，使用GraphPad Prism 7软件进行统计分析。定量数据以均值±标准差（SD）表示，两组间比较采用Student's t检验，多组间比较采用双因素方差分析（two-way ANOVA）结合Tukey事后检验，p<0.05被认为具有统计学意义。

三、研究结论

1. 成功制备了负载Fe₂O₃纳米颗粒的3D打印PLGA复合支架（PLGA、P10F、P20F、P30F），该支架具有分级多孔结构，Fe₂O₃颗粒尺寸均匀（平均约27.8nm），分散良好。随着Fe₂O₃含量增加，支架表面亲水性增强（P20F为亲水性），压缩模量和强度提高，且具有良好的超顺磁性和降解性能，在降解过程中Fe³⁺缓慢释放。

2. 体外实验表明，PLGA/Fe₂O₃支架具有优异的生物相容性，能够支持hBMSCs和HUVECs的附着、存活和增殖。在静态磁场作用下，该支架显著促进HUVECs的迁移和管形成能力，上调血管生成相关蛋白VEGFR2和HIF-1α的表达；同时，增强hBMSCs的ALP活性和钙沉积，上调成骨相关转录因子Runx2的表达，其中P20F支架表现出最优的成骨和血管生成促进效果，且IONPs本身而非单纯的Fe³⁺释放是发挥作用的关键。

3. 体内实验中，在兔子股骨髁骨缺损模型中，P20F支架在静态磁场刺激下，显著促进新骨形成和血管再生，micro-CT分析显示其BV/TV、Tb.N、BMD显著高于对照组和PLGA组，Tb.Sp显著降低，血管体积也明显增加；组织学分析进一步证实P20F组OCN、CD31和VEGFA的表达水平最高。

4. 蛋白质组学和生物信息学分析揭示，PLGA/Fe₂O₃支架在静态磁场下，通过上调hBMSCs中CRYAB的表达，激活PI3K-AKT信号通路，CRYAB与β-连环蛋白结合并稳定其表达，进而促进成骨分化；在HUVECs中，激活NF-κB/HIF-1α信号通路，上调VEGF表达，促进血管生成。

5. 本研究首次证实CRYAB介导的β-连环蛋白稳定在磁性支架诱导的骨再生中起核心作用，为功能性骨替代物的设计提供了新的见解，同时也为骨缺损的治疗提供了一种有潜力的策略。

四、论文信息