1. 介绍

工程化活体材料（ELMs）是将活细胞与非活基质结合形成的生物混合系统，具有可编程功能性。这些材料利用合成生物学技术使细胞执行用户定义的任务，如环境感应、高价值化合物生产等。然而，要充分发挥ELMs的潜力，需要将其与能够处理和转化这些材料的制造技术相结合。生物3D打印技术通过逐层沉积含有活细胞的生物墨水来构建3D结构，同时保持细胞活性，为ELMs提供了一个有前景的制造平台。文章强调了将生物3D打印与ELMs结合的潜力，这种结合不仅利用了3D打印结构的几何功能性，还利用了ELMs的遗传可编程性，将这些材料转化为实用产品和工程解决方案。

图1 用于制造ELM 3D结构的3D打印模式

2. 生物3D打印技术

作者首先展示了用于制造工程化活体材料（ELMs）的四种3D打印模态：基于挤出的3D打印、在支撑浴中嵌入式3D打印、基于光的3D打印和体积3D打印。

基于挤出的3D打印：通过喷嘴逐层挤出生物墨水丝来构建3D结构，通常需要后处理交联来稳定打印结构。

嵌入式3D打印：在支撑浴中则将生物墨水打印到屈服应力介质中，该介质在打印过程中临时支撑结构，直到后处理交联，降低了对生物墨水流变性能的要求。

基于光的3D打印（如数字光处理，DLP）：利用图案化光选择性交联光敏生物墨水，逐层构建细胞封装的3D结构，具有高通量和高分辨率，但需要低粘度的光交联生物墨水。

体积3D打印：通过光学层析投影同时产生整个3D对象，具有快速打印和无需支撑结构等优势，但需要透明、大量生物墨水，限制了其在高成本材料或大型结构制造中的应用。

图2 基于挤出的生物3D打印

接着展示了基于挤出的生物3D打印机的生物墨水特性及其对打印过程的影响。图中对比了凝胶相生物墨水和液相生物墨水，凝胶相生物墨水具有剪切变稀和自修复特性，这对于实现高分辨率和高保真度的3D打印至关重要。剪切变稀行为使生物墨水在受到应力时从类固态转变为液态，便于挤出；而自修复行为则使其在挤出后恢复类固态，防止扩散，从而实现高打印保真度。图中还展示了生物墨水在振荡应变扫描下的流变特性，以及在低应变下表现出类固态、在高应变下转变为液态的特性。此外，图中介绍了通用生物墨水平台的概念，例如互补网络生物墨水和通用临时网络生物墨水。

图3 生物制造窗口的概念

“生物制造窗口”的概念强调了在生物3D打印中，生物墨水的流变特性需要在3D可打印性和细胞兼容性之间找到一个平衡点。为了实现3D打印，生物墨水必须具有足够的粘度和结构稳定性，以形成连续的丝状结构并保持其形状的完整性。然而，为了确保细胞的活性和功能，生物墨水还需要为细胞提供一个适宜的生长环境，避免因过高的粘度或聚合物密度而限制细胞的增殖和代谢。这两个相互矛盾的要求之间的平衡点被称为“生物制造窗口”，它是实现高保真度打印和细胞活性的关键。

图4 在支撑槽中嵌入生物3D打印

在支撑浴中嵌入式3D打印技术用于制造工程化活体材料（ELMs）的过程如图1所示。图中展示了用于支撑浴的聚四氟乙烯（PTFE）微粒，这些微粒具有空气透过性，支持氧气依赖的细胞生长。通过嵌入式3D打印技术，利用空气透过性微粒基质作为支撑介质，可以制造出复杂的细菌纤维素（BC）结构。

图5 ELM的数字光处理生物3D打印

然后展示了数字光处理（DLP）生物3D打印技术在制造工程化活体材料（ELMs）中的应用。图中使用DLP技术打印的网格结构，其中封装了表达绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（mCherry）的大肠杆菌。DLP技术可以同时封装多种细胞类型，并且通过不同分子量的聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）作为水凝胶基质，可以调控细胞的生长和分布。

图6 体积生物3D打印

体积生物3D打印（VBP）技术及其在制造工程化活体材料（ELMs）中的应用如图所示。图中展示了将顺序嵌入式打印与体积打印相结合的过程，利用光学层析投影同时产生整个3D对象。这种技术允许在体积打印形成的3D对象内封装通过挤出式生物打印制造的3D结构，从而实现多材料结构的制造。

图7 用于工程活体结构生物3D打印的合成生物学

3. 当前挑战和潜在机遇

作者展示了合成生物学在生物3D打印工程化活体材料（ELMs）中的应用。图中展示了通过基因工程改造的微生物细胞分泌的CsgA融合蛋白和TasA淀粉样蛋白融合蛋白，这些蛋白可以自组装成具有剪切变稀特性的纤维网络，形成适合3D打印的生物墨水。

图8 3D打印活体结构的后打印生长

图8展示了3D打印的活体菌丝结构在打印后通过菌丝生长进行结构演化和功能增强的过程。展示了菌丝在打印结构中的生长过程，以及菌丝在结构受损后的自愈能力。随着时间的推移，菌丝在结构内部生长，填充空隙并增强结构的机械性能。

图9 4D打印

4D打印技术，即利用形状记忆材料或刺激响应性材料制造能够在特定刺激下改变形状的结构。图中展示了两种4D打印方法：生物模拟4D打印和数字光4D打印。生物模拟4D打印通过挤出式3D打印制造双层水凝胶结构，利用各向异性的膨胀实现形状转换。数字光4D打印则通过数字光投影技术将3D目标形状转换为2D平面，然后通过光刻技术实现形状转换。

图10 形状变形材料与ELM的生物3D打印集成

作者展示了将形状变形材料与工程化活体材料（ELMs）的生物3D打印相结合的概念。图中展示了由酵母细胞增殖引起的ELM体积膨胀，以及通过空间控制细胞增殖实现的形状变形。通过使用图案化的紫外线（UV）光照射，可以选择性地杀死细胞，从而在ELM中形成特定的生长区域，实现从平坦结构到类似帽子的形状变形。

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